类黄酮的生物活性作用及其在反刍动物生产中的应用

■李留学 赵玉超 蒋林树* 屠 焰

（1.北京农学院动物科学技术学院，奶牛营养学北京市重点实验室，北京 102206；2.中国农业科学院饲料研究所，北京 100081）

随着促生长类药物饲料添加剂（中药类除外）被禁用，类黄酮成为国内外研究替抗产品关注的热点。类黄酮是一类天然植物的次生代谢产物，具有众多生物活性作用，在饲料中添加类黄酮可提高反刍动物的生产性能，增强其免疫力。类黄酮具有多种生物活性作用，如抑菌、抗氧化、抗炎和抗肿瘤等，其广泛的生物活性作用可能用于调节氧化应激—炎症反应—免疫调节三方联动反应，减少非传染性疾病的发生，维持动物体内自由基稳态和免疫稳态，促进机体健康。文章重点介绍了类黄酮的生物活性作用及其在反刍动物生产中的应用，为类黄酮在反刍动物生产中的应用提供参考。

1 类黄酮的分类

类黄酮（Flavonoids）是以苯并吡喃酮为基本母核的一类化合物，现在类黄酮泛指以两个含有酚羟基的苯环（A 环和B 环）为基本骨架，通过中心三碳原子（通常会形成一个含氧杂环）相互连接形成的一类化合物。类黄酮在植物中以糖苷、苷元和甲基化衍生物的形式存在，其中糖苷是最主要的存在形式。根据三碳链（C3）的氧化程度、是否成环以及B 环连接位点等，可将类黄酮划分为黄酮类、异黄酮类、查耳酮类、橙酮类、双氢黄酮类等以及它们各自的衍生物。

2 类黄酮的生物活性

2.1 抗氧化

当机体处于病理或外界有害刺激时，体内的活性氧（ROS）产生速率大于机体抗氧化剂（内源性）的清除速率，自由基就会在体内大量积累。自由基具有高反应性，会攻击细胞膜上的脂质、机体中的蛋白质以及DNA，诱导机体产生严重的氧化反应，导致细胞膜结构和功能发生改变以及蛋白质和DNA损伤。机体内的抗氧化剂（内源性）不足以清除累积的自由基时就需要从体外补充抗氧化剂（外源性）。类黄酮可通过酚羟基提供电子或氢原子与自由基发生反应，从而终止自由基的链式反应。其抗氧化作用主要包括：①抑制参与ROS 生成酶的活性（微粒体单加氧酶、P450 酶系、谷胱甘肽S-转移酶、环氧化酶、线粒体琥珀氧化酶、黄嘌呤氧化酶、NADH 氧化酶等）；②螯合催化自由基产生的金属离子（Fe3+、Cu2+）；③直接清除ROS；④保护和上调抗氧化系统；⑤促进抗氧化物质再生等。

类黄酮抗氧化活性的强弱与其结构密不可分，一般认为酚羟基的数量越多其抗氧化活性越强。Jeong等（2007）通过运用DPPH 自由基溶液化学分析法对11种含有多种羟基的类黄酮抗氧化活性作出评价，结果显示木犀草素（3，5，7，3'，4'-OH）比槲皮素（5，7，3'，4'-OH）具有更高的抗氧化活性，但是，B环中酚羟基达到一定数量其抗氧化活性则不再增强。此外，羟基取代基的位置对其抗氧化活性也有显著影响。类黄酮还可以通过增强机体内抗氧化酶（SOD、CAT、GSH-Px）的活性，提高抗氧化酶清除自由基的能力，以此达到抗氧化效果。

2.2 抗炎

类黄酮主要是通过影响花生四烯酸（arachidonic acid，AA）的代谢途径、细胞信号传导途径、炎性细胞因子分泌以及调节氧化应激等方面发挥抗炎作用。在炎症反应中环氧合酶（cyclooxygenase，COX）和脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）可引起炎性细胞因子释放，是炎症反应发生的起点，而且COX 和LOX 不仅与花生四烯酸的形成有关，还可催化花生四烯酸转变为前列腺素（PG）参与机体各种免疫应答反应。研究表明，类黄酮如木犀草素、儿茶素、没食子酸儿茶素和槲皮素等可以通过抑制COX 和LOX 的活性，影响前列 腺 素E2（PGE2）、白 三 烯（LTB）和 血 栓 素A2（TXA2）的前体物质AA 的释放进而阻断炎症链式反应。类黄酮还可以通过影响丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核转录因子(NF-κB)信号传导途径发挥抗炎作用。Kang 等（2011）通过阻断LPS 刺激小鼠单核巨噬白血病细胞(RAW264.7)的NF-κB 和MAPK 信号通路，检测类黄酮（橙皮苷、川陈皮素和柚皮苷）在抑制促炎介质方面的作用，结果表明，类黄酮通过抑制c-JunN 氨基末端激酶（JNK）、细胞外调节蛋白激酶（ERK）和p38 丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）的磷酸化，进而抑制MAPK 信号通路的活化，发挥抗炎作用。

类黄酮（如芹菜素、柚皮素、花青素、木犀草素和槲皮素等）还可以通过抑制白细胞介素6（IL-6）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）等促炎因子的表达抑制或阻断炎症反应的发生。Zhang等（2020）选用169名血脂异常的受试者随机分为6组，用于评估花青素在体内对IL-6和TNF-α的影响，结果表明，受试者补充80 mg∕d花青素后，可显著降低12 周时血清中IL-6 和TNF-α的含量，证明了花青素具有减轻炎症反应的作用。很多与炎症反应启动有关的炎性因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）以及诱生型一氧化氮合酶（iNOS）和环氧合酶（COX-2）等的转录受到NF-κB 信号通路的调控。机体内高浓度的ROS不仅可以通过NF-κB信号通路上调促炎因子（IL-6、IL-1β、TNF-a）的表达，引起炎症反应而且其还可与核酸、蛋白质和脂质反应导致机体产生氧化应激，引起与炎症启动有关的COX 和LOX 基因表达进而促进炎症反应的发生。类黄酮还可通过抑制NF-κB信号通路中参与ROS生成酶的表达，减少机体ROS的产生，进而阻断炎症反应的发生。

2.3 抗菌

类黄酮具有广泛抗菌性，其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、李斯特菌和沙门氏菌等具有强烈抑制作用。类黄酮的抗菌活性与母核上羟基的数量和位置有关，特别是C-3、C-5和C-7上羟基取代基具有较强抑菌活性，而芳环甲基化则降低其抑菌活性。其次，有研究表明，类黄酮含有疏水取代基（烷基氨基链、烷基链、异戊二烯基、含氮或氧的杂环部分）或B环发生卤化现象时会增强其抑菌活性。类黄酮主要是通过抑制或直接杀死细菌和减弱细菌毒性方面发挥抗菌作用，其发挥直接抗菌作用主要依赖于以下3 种机制：①抑制菌体核酸合成，类黄酮通过DNA 促旋酶和拓扑异构酶Ⅳ干扰拓扑异构酶的活性，使DNA双螺旋结构发生断裂，导致细菌核酸合成受阻；②抑制菌体细胞膜功能，类黄酮通过增加细菌细胞膜的通透性或减弱其流动性破坏菌体胞浆膜结构；③抑制菌体能量代谢，类黄酮可与三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA cycle）过程中的关键酶苹果酸脱氢酶（malate dehydrogenase，MDH）结合导致酶分子结构发生改变和酶活性降低，从而抑制需氧菌的三羧酸循环，阻断糖代谢过程，导致细菌体腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）和还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide reduced，NADH）合成受阻，进而抑制菌体呼吸代谢过程，导致细菌生长受阻。

类黄酮还可以通过直接抑制菌体NADPH-细胞色素C 还原酶（NADPH-cytochrome C Reductase）的活性，阻碍菌体呼吸链电子传递，抑制呼吸代谢和能量代谢过程，抑制菌体生长。在减弱细菌毒素方面，类黄酮能抑制与细菌感染性相关的分选酶和脲酶活性，中和细菌毒素，抑制毒力因子释放，发挥抗菌功效。

2.4 抗肿瘤

类黄酮因其具有独特的生物活性，可作为抗肿瘤药物的潜在候选物。其可通过促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖发挥抗肿瘤作用。类黄酮通过上调促凋亡蛋白（Bax，Bad）和下调抗凋亡蛋白（Bcl-2，Bcl-6）的表达，引起由线粒体调节的内部凋亡途径启动，诱导肿瘤细胞发生凋亡，并可通过促进细胞色素C 的释放诱导凋亡蛋白级联反应从而促进肿瘤细胞凋亡。类黄酮可以调节细胞周期蛋白（cyclinD，cyclinE）和细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclindependent kinase, CDKs）影响肿瘤细胞分裂周期，导致肿瘤细胞停滞于G0或G1期，从而阻止其有丝分裂和DNA 复制过程，抑制肿瘤细胞生长和增殖。端粒酶是一种核糖核蛋白（RNP），在正常细胞中几乎不表达，但在恶性肿瘤细胞中表达率却可达80%以上，类黄酮可通过抑制端粒酶活性使其在肿瘤细胞中不发生表达进而诱导肿瘤细胞发生凋亡。癌细胞不受控制地增殖、侵袭和迁移需要新生血管不断为其提供营养物质。有研究表明，类黄酮可以抑制肿瘤血管上皮的生长阻止新生血管的形成，阻止肿瘤细胞的生长和增殖。

3 类黄酮在反刍动物生产中的应用

3.1 类黄酮对反刍动物生长性能的影响

类黄酮具有众多生物活性作用，在饲料中添加类黄酮可提高动物生长性能，增强其免疫力。类黄酮对反刍动物生长性能的影响主要体现在提高反刍动物的饲料转化率和日增重方面，从而促进其生长。有研究表明，在荷斯坦奶牛日粮中添加适量苜蓿黄酮能提高奶牛采食量并对其产奶量有一定促进作用，其中以添加60 g 苜蓿黄酮的效果最佳。陈圣阳等（2018）采用单因素随机区组设计，分别在肉羊基础日粮中添加0、11、22、33 mg∕kg 沙葱黄酮研究沙葱黄酮对肉羊生长性能的影响，结果表明，沙葱黄酮可显著提高肉羊的平均日采食量和降低料重比，其中以添加22 mg∕kg沙葱黄酮组的平均日采食量最高，33 mg∕kg沙葱黄酮组的料重比最低。刘艳丰（2019）试验发现阿勒泰羊饲喂沙棘叶和沙棘黄酮，在不改变瘤胃发酵模式下，沙棘叶和沙棘黄酮可通过提高瘤胃VFA和降低NH3-N 浓度，促进瘤胃代谢和微生物蛋白合成，提高阿勒泰羊的采食量和日增重，并可降低其脂肪率和腹脂率；通过对其血清生化指标分析，进一步发现沙棘叶和沙棘叶黄酮还可通过增加总蛋白和降低血清尿素氮促进阿勒泰羊生长。Kong 等（2019）在研究桑叶黄酮和热带假丝酵母单独或联合添加对断奶前后犊牛瘤胃发酵特性的影响试验中发现，单独添加桑叶黄酮时，犊牛在断奶后和整个断奶期间的平均日增重和饲料效率均显著提高。另有研究发现，在东北细毛羊日粮中添加大豆黄酮可显著提高其采食量和日增重，并可显著提高羊只屠宰率和胴体重。杨春涛（2016）在研究日粮中添加桑叶黄酮对断奶前后犊牛生长的影响中发现，在断奶犊牛日粮中添加桑叶黄酮可提高犊牛免疫力，降低腹泻率，提高饲料转化率，提高犊牛的日增重。由此可见，日粮中添加适量类黄酮可通过改变瘤胃发酵类型，提高机体免疫力和采食量进而间接促进反刍动物的生长。

3.2 类黄酮对反刍动物泌乳性能和乳品质的影响

有研究发现，在荷斯坦奶牛日粮中添加大豆异黄酮能显著提高产奶量，其中，添加30 mg∕kg 大豆异黄酮的试验组在第42天的产奶量与对照组相比提高了21.8%，且对乳蛋白和乳脂率无影响。另有研究发现，不同水平的大豆异黄酮可提高泌乳早期荷斯坦奶牛的平均日产奶量，且添加剂量为30 mg∕kg时可提高乳蛋白含量，这与上述试验在同一添加剂量时对乳蛋白的影响不一致，可能是由于两组试验选择的奶牛泌乳期不同造成的。大豆黄酮不仅能够提高奶牛产奶量，还能显著提高牛奶中乳脂、乳蛋白和乳糖的含量，进而提高乳品质。Li 等（2020）在探究日粮中添加桑叶黄酮对水牛产奶量的影响中发现，添加45 g∕d的桑叶黄酮可显著提高水牛的日产奶量、乳蛋白和乳脂率。Cui 等（2015）分别在荷斯坦奶牛日粮中添加0、1.5、3.0、4.5 mg∕kg 芦丁，探究其对奶牛泌乳性能的影响，试验结果表明，添加3.0 mg∕kg 和4.5 mg∕kg 芦丁的奶牛产奶量显著高于对照组，分别提高10.06%和3.37%，但乳蛋白、乳糖和乳无脂固形物含量在各组间差异不显著。另有研究发现，一些类黄酮对反刍动物产奶量和乳品质无影响。Zhan 等（2017）采用4×4 拉丁方设计探究苜蓿黄酮类化合物对奶牛生产性能和瘤胃发酵的影响，结果表明，苜蓿黄酮对产奶量、乳中脂肪、蛋白质和乳糖含量无影响，但随着苜蓿黄酮添加量的增加，乳中总固形物含量呈线性下降。Dschaak 等（2017）在研究坚木单宁提取物（CTE）对奶牛瘤胃发酵和泌乳性能的影响试验中，发现在日粮中添加CTE 对泌乳奶牛产奶量和乳成分没有影响。

3.3 类黄酮对反刍动物瘤胃发酵的影响

瘤胃是反刍动物的天然发酵罐，瘤胃中的微生物与反刍动物存在一种共生关系，反刍动物为瘤胃微生物提供适宜的生存环境，而瘤胃微生物则通过降解饲料中碳水化合物等物质产生大量挥发性脂肪酸（volatile fatty acids, VFA）和微生物蛋白，为反刍动物提供能量和蛋白质来源。据研究表明，反刍动物通过瘤胃微生物发酵产生VFA 能为机体提供70%～80%的能量，产生的微生物蛋白占小肠可吸收蛋白的50%～80%。在体外模拟瘤胃发酵试验中发现，在底物中添加1.0 mmol∕L和2.0 mmol∕L槲皮素显著提高了底物在24 h内的总产气量；添加1 mmol∕L槲皮素显著提高了发酵液中乙酸和丁酸浓度；添加2 mmol∕L槲皮素显著提高了发酵液中乙酸、丙酸、丁酸及总挥发性脂肪酸（TVFA）浓度。包玲玲等（2015）研究表明，日粮中添加沙葱黄酮类化合物能显著提高瘤胃产气量并在添加剂量为0.032 mg 时提高幅度最大。柚皮苷的体外模拟瘤胃发酵试验发现，柚皮苷提高了发酵液24 h内的总产气量、TVFA 浓度以及乙酸和丁酸的比例，降低了戊酸比例。反刍动物体内研究发现，在绵羊日粮中分别添加0、0.1%、0.2%和0.4%苜蓿黄酮能减小绵羊24 h内瘤胃pH的变化范围，增加VFA 的变化幅度，提高TVFA 浓度；在添加0.2%和0.4%苜蓿黄酮时增加了绵羊氨态氮浓度，表明苜蓿黄酮能够改善绵羊瘤胃发酵功能。包玲玲（2015）研究表明，日粮中添加沙葱黄酮类化合物降低了氨态氮浓度，提高了菌体蛋白的合成，显著提高了TVFA 的浓度，降低了乙酸和丙酸的比例。以上体内外研究表明，类黄酮可改变瘤胃发酵，主要体现在影响挥发性脂肪酸的比例和降低氨态氮浓度及产气量方面。

4 小结

类黄酮以其来源广泛、无毒、无副作用等特点和多种生物活性优势可作为一种具有广阔应用前景的饲料添加剂应用到反刍动物生产实践中。但目前类黄酮在反刍动物生产中的应用仍存在许多问题。首先，虽然类黄酮种类众多，在自然界中的数量高达9 000 多种，但其在反刍动物中的研究甚少，且不同类黄酮在同一反刍动物中或同一类黄酮在不同反刍动物中有不同的最佳添加剂量，不能形成统一的标准。其次，虽然对类黄酮的生物活性作用已有了较多研究，但其在反刍动物机体中的作用机制和发挥活性作用的主效因子尚不清楚，不能科学阐释其在反刍动物体内是如何发挥作用进而提高生长性能。所以，后期可从类黄酮的开发、单一类黄酮化合物在反刍动物机体内的吸收、分布、代谢方面出发，深入探究其在机体内的代谢途径与机制及发挥活性作用的主效因子，为类黄酮在反刍动物生产中的应用提供科学依据。