黑曲霉木聚糖酶GH10 Xyn4配伍新丽鞭毛菌GH11 Xyn1B降解木聚糖的协同作用

■姬慧鑫 付涵芬 陈晓艺 陈红歌 刘新育

（河南农业大学生命科学学院，农业农村部农业微生物酶工程重点实验室，河南郑州450002）

半纤维素是存在于植物细胞壁中与纤维素、细胞壁蛋白质、木质素、果胶等通过共价键或非共价键结合的一类基质多糖[1]，是自然界中继纤维素后最丰富的可再生资源，木聚糖是植物半纤维素的主要成分。在小麦等谷物中，阿拉伯木聚糖的存在严重影响了饲用小麦中营养物的吸收效率，而添加木聚糖酶不仅可以有效地解除木聚糖的抗营养作用，还可以提高纤维分解酶活力、总细菌和主要纤维分解菌数量[2]。

按催化结构域氨基酸的同源性，能够降解β-1,4糖苷键的木聚糖酶分布在GH5、GH8、GH10、GH11和GH30 等糖苷水解酶家族中[3]，其中主要由GH10 和GH11 家族木聚糖酶参与降解过程。GH10 木聚糖酶多为多结构域，除了拥有催化结构域之外，部分还具有碳水化合物结合模块（CBM）[4]，其降解产物主要为单糖。GH11家族木聚糖酶能够特异性地切割不同结构的木聚糖主链，产物中寡聚糖含量较多，多集中在木二糖和木三糖[5]。当GH11 和GH10 家族的木聚糖酶联用时，将会使木聚糖降解更为高效。

由于小麦中存在对木聚糖酶活性具有抑制作用的蛋白成分，小麦中XIP木聚糖酶抑制剂对目前市场上主要真菌来源的GH11和GH10家族木聚糖酶均有不同程度的抑制作用[6]。Danisco 动物营养分公司建议采用木聚糖酶抑制蛋白含量较高的饲用小麦时，应该施加更高用量的木聚糖酶[7]，或者需要筛选使用对XIP 抑制蛋白具有抗性的木聚糖酶。植物病原真菌Fusarium graminearum来源的GH11木聚糖酶XylA和XylB[8]，以及动物瘤胃厌氧真菌新丽鞭毛菌(Neocallimastix patriciarum)来源的GH11 木聚糖酶Q9U 和Xyn1B[9]对XIP抑制蛋白具有强烈抗性，此类抗性木聚糖酶用于富含抑制蛋白的小麦原料降解，将会有效地提高用酶效果。本研究旨在筛选出具有最佳酶解效率的GH11 抗性木聚糖酶，并探究其与GH10 木聚糖酶在木聚糖降解过程中的协同作用。

1 材料和方法

1.1 试验材料

哈茨木霉GH11 敏感木聚糖酶XynHar 为市售商品酶并经分离纯化所得纯酶，黑曲霉GH10 敏感木聚糖酶Xyn4、瘤胃真菌新丽鞭毛菌GH11抗性木聚糖酶Q9U、瘤胃真菌新丽鞭毛菌GH11 抗性木聚糖酶Xyn1B 均经大肠杆菌BL21（DE3）异源表达并亲和纯化所得重组木聚糖酶；山毛榉木聚糖购自Megazyme公司（货号P-XYLNBE-10G）。

1.2 主要仪器

JY92-II超声波细胞粉碎机（宁波新芝生物科技有限公司）、UV-2550紫外-可见分光光度计[尤尼柯（上海）仪器有限公司]。

1.3 试验方法

1.3.1 3，5二硝基水杨酸（DNS）反应液的配制

参照Verhoeven等[7]的方法配制DNS反应液。

1.3.2 茴香醛-硫酸显色液的配制

4 mL 浓硫酸加至含2 mL 茴香醛的200 mL 乙醇溶液中（于通风橱中操作），要现用现配。

1.3.3 木聚糖溶液的配制和木聚糖酶活力测定

木聚糖溶液：准确称取0.2 g 山毛榉木聚糖溶解于10 mL 柠檬酸-磷酸缓冲液（pH 5.0）中，沸腾水中煮沸3～5 min至其完全溶解，可得2%木聚糖溶液。

木聚糖酶溶液：按照Beliën 等[8]的方法测定木聚糖酶酶活力后，将本试验中使用的GH11 和GH10 木聚糖酶配制为酶活力0.879 IU∕mL的溶液OD。

1.3.4 不同木聚糖酶浓度对产糖量的影响

在100 μL 底物中依次分别加入100、200、400、600 μL的GH10 Xyn4及GH11 Xyn1B酶溶液（在冰浴条件下进行），40 ℃水浴锅中温浴2 h，分别取出100、200、400、600 μL的反应液，加入3倍体积的DNS溶液终止反应，煮沸10 min 显色，定容至5 mL，混匀后在550 nm波长下测定其吸光值。

1.3.5 不同反应时间对木聚糖降解的影响

在四等份100 μL 底物中依次分别加入100 μL GH10 Xyn4 及GH11 Xyn1B 酶溶液（在冰浴条件下进行），40 ℃水浴锅中温浴0.5、1、2 h和4 h，取出100 μL反应液加入300 μL DNS溶液终止反应，煮沸10 min显色，定容至5 mL，混匀后在550 nm波长下测定其吸光值。

1.3.6 最佳GH11 和GH10木聚糖酶不同比例复配对产糖量的影响

在100 μL 底物中加入100 μL 按照1∶9、9∶1、3∶7、7∶3、5∶5 不同比例复配的GH11 Xyn1B 和GH10 Xyn4木聚糖酶混合液，40 ℃水浴锅中分别温浴0.5、1、2 h 和4 h，取出100 μL 反应液加入300 μL DNS 溶液终止反应，煮沸10 min 显色，定容至5 mL，混匀后在550 nm波长下测定其吸光值。

1.3.7 薄层层析法（TLC）鉴定木聚糖酶产糖类型

吸取0.5 μL 反应液点样，吹风机吹干后再次加样，如此重复后加样至2 μL，要注意点样直径不能大于2 mm。待点样结束并完全干燥后，将薄层板稍微倾斜一定角度放入展开剂（乙酸乙酯∶乙酸∶甲醇∶水=12∶3∶3∶2）中上行展开15～20 min，展开剂至薄板上边缘约1 cm 处，取出晾干，放入茴香醛-硫酸显色液后即刻取出平置，用吹风机吹干显色；采用灰度分析软件Image J分析显色区域的面积。

2 结果与分析

2.1 不同GH11木聚糖酶对产糖量的影响（见图1）

通过DNS 法检测酶解产物，研究三种GH11木聚糖酶在相同条件下的产糖量，结果见图1。结果发现，在相同的酶浓度和反应条件下，Xyn1B 酶解产物的OD值最高，故选取Xyn1B继续进行后续研究。

图1 三种GH11木聚糖酶的酶解产糖量

2.2 木聚糖酶用量对产糖总量的影响（见图2）

通过使用不同用量的木聚糖酶，检测GH11 抗性木聚糖酶Xyn1B 和GH10 木聚糖酶Xyn4 酶解产物差异，结果见图2。本试验剂量浓度条件下，Xyn1B 比Xyn4的产糖量要高；其中Xyn4随着酶量的增加其OD值呈现持续增加趋势，而Xyn1B 在酶量为400 μL 时产糖量接近峰值，之后有进入平台期的趋势。

图2 木聚糖酶不同用量对产糖量的影响

2.3 不同反应时间对木聚糖酶产糖量的影响（见图3）

通过检测不同反应时间时酶解产物中的糖量，研究GH11 抗性木聚糖酶Xyn1B 和GH10 敏感木聚糖酶Xyn4 水解性能的差异，结果见图3。结果发现，本试验条件下，随着反应时间增加，Xyn1B 和Xyn4酶解产物的OD值均呈缓慢增加趋势。

图3 不同反应时间对产糖量的影响

2.4 GH11和GH10木聚糖酶不同比例复配使用对产糖量的影响（见图4、图5）

将相同酶活力的GH11 木聚糖酶Xyn1B 和GH10木聚糖酶Xyn4 按照不同比例进行复配，测定其对木聚糖降解的影响，结果见图4、图5。整体来看，复配酶液酶解时的产糖量均高于单独的Xyn1B GH11 或Xyn4 GH10木聚糖酶，反应时间2 h时，Xyn1B∶Xyn4为3∶7 和5∶5 时产糖量可以达到最高，相比单独用酶提高了约21%，将OD 值通过标准曲线换算成糖量约为0.97 μmol；薄层层析结果经Image J 软件进行灰度分析发现，酶解产物中木糖含量较少，以3∶7、5∶5和7∶3 配伍的酶解产物中木二糖和木三糖含量较高，尤其是5∶5 配伍酶的木二糖产量相比1∶9 配伍酶提高了52%，未知大小的木寡糖产量提高了77%。

图4 GH11和GH10家族木聚糖酶复配比例对产糖量的影响

图5 反应时间为2 h时不同酶比例产糖情况

3 讨论

GH10木聚糖酶降解木聚糖的降解产物多集中在单糖，GH11木聚糖酶的产物中寡聚糖含量较多，多集中在木二糖和木三糖，但如果想高效并且彻底地降解侧链修饰的木聚糖，不仅需要纤维素酶、乙酰木聚糖酯酶等侧链酶，还需要GH10 木聚糖酶和GH11 木聚糖酶等主链降解酶的协同降解[10]。木寡糖作为益生元可促进肠道有益细菌的生长并分泌短链脂肪酸，有利于维持肠道生态平衡和改善胃肠健康[11]。在面包焙烤和啤酒生产中，抗抑制蛋白的木聚糖酶通过较好地降解谷物原料中木聚糖[9,12]，外加较少的木聚糖酶即可达到酶解效果。

本试验利用纯的木聚糖作为底物研究了抗性GH11木聚糖酶与GH10木聚糖酶的协同作用，取得了一定的应用效果，然而不同的饲料组成，以及饲料中小麦或玉米由于生长环境不同导致所含抑制蛋白的含量也会发生变化，这些变化对饲料中添加木聚糖酶的应用效果产生影响，因此在木聚糖酶使用时还需要注意通过测定抑制蛋白的含量，以精准确定木聚糖酶的最终添加量。

另外，消化液中胃蛋白酶可能对外加的抗性木聚糖酶的稳定性影响较大，会削弱其应用效果，因此有必要针对消化液进一步提高抗性木聚糖酶的稳定性，并通过动物体内试验才能最终验证应用效果。

4 结论

试验选择的3 种GH11 木聚糖酶中，以瘤胃真菌新丽鞭毛菌来源的GH11抗性木聚糖酶Xyn1B的催化效率最高，所得酶解产物的OD值最高；Xyn1B在酶量为400 μL时产糖量接近峰值。GH11木聚糖酶Xyn1B和GH10木聚糖酶Xyn4按照不同比例进行复配时，复配酶液催化产糖量均高于单独酶液，在反应时间2 h时，Xyn1B∶Xyn4 为5∶5 时产糖量最高，酶解产物中木寡糖含量明显增多，且其中以木二糖和木三糖含量最丰富。