不同蜡样芽孢杆菌对玉米籽粒中黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和呕吐毒素脱毒效果及营养成分评价

2022-12-20张桂杰

饲料工业 2022年23期

■石楠张桂杰

（宁夏大学农学院，宁夏银川 750021）

玉米具有来源广，营养价值高和适口性好等特点，在饲料工业中占有重要地位，然而运输或储存不当时往往会导致霉菌毒素超标。玉米籽粒中常见霉菌毒素有黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）、玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）和呕吐毒素（Deoxynivalenol，DON）等，且会发生两种或两种以上毒素侵染情况。我国现行标准GB 13078—2017 中玉米饲料原料毒素标准规定：玉米饲料原料中AFB1≤50 g∕kg、ZEN≤0.5 mg∕kg、DON≤5 mg∕kg。霉菌毒素侵染会破坏玉米籽粒营养成分和适口性，畜禽摄入后会引起拒食、饲料转化率低、生长缓慢、雌激素效应、免疫抑制等情况，从而降低畜牧收益，故降低玉米籽粒中霉菌毒素含量水平刻不容缓。

物理法、化学法和生物法是常用霉菌毒素脱毒方法。与物理法和化学法相比，生物法效率高、安全、成本低，且添加部分微生物还可提高饲料营养价值，被动物食用后有益于肠道健康，适合大规模生产。生物法脱毒霉菌毒素研究中，芽孢杆菌因繁殖快、可产生对霉菌毒素具有脱毒效果的肽酯类物质，目前已成为生物法脱毒霉菌毒素的研究热点。有学者通过平板筛选法结合玉米活体筛选法分离到一株芽孢杆菌对黄曲霉菌抑制率为79.20%，对1 μg∕mL AFB1脱毒率为68.39%。Tinyiro等（2011）研究结果表明，所筛选枯草芽孢杆菌168 和纳豆芽孢杆菌CICC 24640 培养液在30 ℃有氧培养24 h 后对ZEN 的脱毒率分别为81%和100%。麸皮发酵试验显示，接菌量109CFU∕kg、含水量40%、压实发酵的情况下，发酵5 d对DON脱毒率为73.25%。目前学者研究多为筛选菌株对某单一霉菌毒素脱毒，而饲料中通常被两种及两种以上霉菌毒素污染，故筛选对多霉菌毒素高效脱毒的微生物对饲料毒素脱毒具有重大意义。本试验将3株蜡样芽孢杆菌菌液添加到玉米籽粒中，探究对AFB1、DON和ZEN 3种霉菌毒素联合脱毒的效果，为多种霉菌毒素同步生物脱毒提供依据。

1 材料与方法

1.1 霉菌毒素超标玉米籽粒制备

PDA培养基（青岛高科技工业园海博生物技术有限公司）经121 ℃、15 min高压蒸汽灭菌，接种寄生曲霉菌种和镰刀菌种，恒温生化培养箱中培养7 d。在三角瓶中加入150 mL 灭菌生理盐水和1 mL 培养7 d后的菌液，在恒温振荡器35 ℃、120 r∕min振荡30 min，使霉菌孢子悬浮，静置待用。将粉碎后的玉米籽粒含水量调到30%左右，每2 kg 左右分装塑封袋中，经121 ℃、15 min灭菌后冷却至室温。在恒温培养箱内将玉米籽粒均匀摊开后，用喷雾器把含有寄生霉菌孢子溶液均匀喷洒在其表面。培养期间每天喷水一次，搅拌一次，保持含水量在30%左右，同时维持培养基中正常含氧量以利于霉菌生长。发酵结束后培养基表面结块并且发绿，说明上面已布满大量霉菌菌落。玉米籽粒霉变后所含AFB1、DON 和ZEN 及营养成分如表1所示。

表1 玉米籽粒霉变后的毒素及主要营养成分含量

1.2 菌液制备

使用NB 培养基（青岛高科技工业园海博生物技术有限公司）培养芽孢杆菌（天津云力之星生物科技有限公司提供），恒温振荡器35 ℃、120 r∕min 振荡培养48 h 后，使用革兰氏染色试剂盒（Aobox）在光学显微镜下采用油镜法进行菌体形态观察，辨别菌液是否污染，直至将菌种使用划线法培养至单一菌落后，使用对应液体培养基将菌株进行扩繁，为脱毒备用。经16S rDNA V3-V4区扩增测序分析，并在NCBI上进行序列比对，均为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus），使用MEGA 7.0绘制菌株系统发育树（见图1）。

图1 菌株系统发育树

1.3 所筛选菌株菌液制备

试验设置对照组、TD-1 芽孢杆菌处理组、TD-2芽孢杆菌处理组和TD-3 芽孢杆菌处理组。菌液活菌数定量至109CFU∕mL，分别添加1%、5%和10%的菌液（基于玉米籽粒重量），将菌液使用喷壶均匀喷洒在玉米籽粒上，并用无菌水将每个处理调至40%，混拌均匀，对照组添加等量无菌水。每个处理6 个重复，每个重复300 g 玉米籽粒，添加无菌水调节处理组和对照组水分至40%后，均匀平铺在20 目无菌标准筛上，根据天津云力之星生物科技有限公司对菌株前期脱毒研究结果，本试验条件为：40 ℃恒温有氧发酵48 h。

1.4 毒素测定

玉米籽粒有氧发酵48 h取样，使用酶联免疫检测试剂盒（江苏晶美生物科技有限公司）进行测定。试剂盒采用竞争ELISA方法，在微孔板包被有毒素偶联抗原，加入毒素标准品或样品，游离毒素与微孔条上预包被的毒素偶联抗原互相竞争抗毒素抗体酶标记物，用TMB 底物显色，加入终止液后颜色由蓝色变为黄色，用酶标仪在450 nm波长下进行检测，吸光值与样品中毒素含量成反比，通过标准曲线计算样品中毒素的含量。

1.4.1 原料前处理

每个处理分别在玉米籽粒置于恒温箱有氧发酵48 h 取样，烘箱（DHG-9055A 型，上海合恒仪器设备有限公司）65 ℃烘干至恒重。取10 g粉碎的样品，加20 mL 70%甲醇溶液（天津市大茂化学试剂厂），使用多管涡旋振荡器（MIX-200 型，上海净信科技有限公司）振荡3 min，再使用离心机（5424R型，Eppendorf生命科学公司）4 000 r∕min 离心8 min 后，用Whatman 1号滤纸过滤，取25 μL上清液。

1.4.2 工作液准备

准备酶联免疫反应所需的AFB1、DON 和ZEN 的标准品溶液，浓缩洗涤液[蒸馏水按1∶20（1+19）稀释备用]，样本稀释液[蒸馏水按1∶10（1+9）稀释备用]，显色剂，反应终止液。

1.4.3 分析步骤

试验开始前请将所有试剂盒充分恢复至室温（25±2）℃，时间约2 h。回温至室温后再取出酶标板。

洗涤程序：预先进行编号，标记B0（空白对照标准孔）、标准品和样品的位置，取所需数量的微孔（微孔条可拆），将多余板条重新密封并立即放回2～8 ℃保存。样品稀释液（10×）、浓缩洗涤液（20×）稀释成工作液(蒸馏水或去离子水稀释)，在B0孔及各标准孔中加入标准品溶液，在所有孔中加入抗体酶结合物，轻轻晃动反应板几秒钟。37 ℃水浴30 min，甩掉孔中液体，用洗液洗涤微孔板5 次，最后一次应在吸水纸上拍打以完全除去孔中液体。

酶联免疫反应：洗涤程序完成后，立即用微量移液器在每个微孔中先加入50 μL 显色液A 和显色液B；轻微晃动反应板使之彻底混匀，37 ℃水浴10 min，每孔中加入50 μL 终止液，混匀。使用酶标仪（VICTOR NIVO型，PerkinElmer）在450 nm下检测吸光度，结果在5 min内读取。

脱毒率计算：计算菌液添加对玉米籽粒中AFB1、DON 和ZEN 的脱毒率。本试验中添加菌液对毒素脱毒原料的效果均以脱毒率呈现。

1.5 营养成分测定

准确称取玉米籽粒300 g，65 ℃烘干48 h 至恒重，烘干样品粉碎过2 mm 筛保存于塑封袋中备用进行化学分析。采用凯氏定氮法测定粗蛋白（Crude protein，CP）含量；纤维分析仪ANKOM A2000i测定中性洗涤纤维（Neutral detergent fiber，NDF）和酸性洗涤纤维（Acid detergent fiber，ADF）含量；蒽酮-浓硫酸比色法测定可溶性碳水化合物（Water soluble carbohydrate，WSC）含量；粗灰分（Crude ash，Ash）含量测定参照张丽英（2007）的方法。

1.6 数据处理

采用Excel 软件对数据进行初步处理，采用SAS 9.3统计软件中ANOVA对脱毒率进行方差分析，并使用Origin 2020进行绘图。营养成分数据采用SPSS双因素分析，参照4×4数据模型。

式中：Yij——玉米籽粒发酵特性和化学组分；

μ——总均值；

Ti——不同接种菌剂的影响（i=1，2，3，4）；

Aj——不同添加量的影响（j=1，2，3，4）；

（A×T）ij——接种菌剂和添加量的交互作用；

eij——试验误差。

当P＜0.05时，表示处理间差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同芽孢杆菌对玉米籽粒中毒素脱毒的效果

2.1.1 不同芽孢杆菌对玉米籽粒中AFB1 脱毒效果（见图2）

图2 有氧发酵后芽孢杆菌对玉米籽粒中AFB1脱毒效果

由图2 所示，有氧发酵48 h后，TD-1芽孢杆菌处理组添加量为5%时，对AFB1 脱毒效果最好，脱毒率为67.59%；TD-2 芽孢杆菌对AFB1 脱毒效果随添加量增加逐渐增高；当TD-3 芽孢杆菌处理添加量为10%时，对AFB1 脱毒效果最佳，在数值上低于5%TD-1芽孢杆菌处理组，但无显著差异（P＞0.05）。

2.1.2 不同芽孢杆菌对玉米籽粒中DON 的脱毒效果（见图3）

图3 有氧发酵后芽孢杆菌对玉米籽粒中DON脱毒效果

由图3 所示，与其他芽孢杆菌处理组相比，TD-1芽孢杆菌处理对玉米籽粒中DON 脱毒效果较好，当添加量为5%时，脱毒率最高（73.03%）。TD-2和TD-3 处理组随着添加量的增加，DON 脱毒率也逐渐增加，当添加量为10%时，对DON的脱毒效果优于1%和5%添加量。

2.1.3 不同芽孢杆菌对玉米籽粒中ZEN 的脱毒效果（见图4）

图4 有氧发酵后芽孢杆菌对玉米籽粒中ZEN脱毒效果

由图4所示，玉米籽粒中添加芽孢杆菌有氧发酵48 h 后，TD-1 芽孢杆菌和TD-3 芽孢杆菌处理组对ZEN 脱毒效果随添加量增加逐渐增加，当添加量为10%时脱毒率达到最大值。TD-2 处理组添加量为1%时，对ZEN脱毒效果最佳，但脱毒率显著低于添加量为10%的TD-1和TD-3处理组（P＜0.05）

2.2 脱毒对玉米籽粒营养成分的影响（见表2）

由表2 可知，在毒素含量超标玉米籽粒中添加菌液好氧发酵48 h 后对营养成分含量的影响。不同处理和不同添加量对玉米籽粒粗蛋白、可溶性碳水化合物和中性洗涤纤维含量影响存在交互作用。当添加TD-1 芽孢杆菌时，1%和10%添加量下的玉米籽粒CP 含量低于5%添加组（P＜0.05）；TD-2芽孢杆菌添加量为10%时，CP 含量低于1%和5%（P＞0.05）；当菌液添加量为1%、5%和10%时，TD-2芽孢杆菌处理组CP 含量均高于TD-1 和TD-3 处理组。不同菌液添加对Ash 含量影响不显著（P＞0.05）。当TD-1 芽孢杆菌添加量为10%，WSC 含量低于1%和5%添加量；当TD-2 芽孢杆菌添加量为1%时，WSC 含量低于5%和10%处理组。发酵48 h的玉米籽粒中NDF 的含量均低于对照组；当添加量为1%时，TD-2 芽孢杆菌处理组NDF 含量高于TD-1和TD-3 芽孢杆菌处理组，且TD-1 芽孢杆菌和TD-3芽孢杆菌不同浓度添加下对玉米籽粒中ADF 含量影响不显著（P＞0.05）。

表2 发酵48 h对玉米籽粒营养成分含量的影响(% DM)

3 讨论

在我国，饲料中AFB1、DON 和ZEN 有着较高检出率和超标率。Zhao 等（2021）在我国不同地区采集饲料样品3 507 份，其中饲料成分2 090 份，完整饲料样品1 417 份，用于调查饲料和饲料原料中霉菌毒素污染情况，调查报告显示：AFB1、DON 和ZEN的超标率分别为81.9%、96.4%和96.9%，AFB1 的平均浓度为1.2～27.4 μg∕kg，DON 的平均浓度为458.0～1 925.4 μg∕kg，ZEN 的平均浓度为48.1～326.8 μg∕kg。当霉菌毒素超标饲料进入畜禽体内后，会降低畜禽机体免疫力，长时间摄入对畜禽机体具有致癌性、基因毒性和生殖毒性等，会严重危害畜禽健康从而降低畜禽产品质量，进而危害人类健康。此外，这些霉菌毒素通常以两种或两种以上的毒素出现在饲料中，毒性往往远大于单一毒素的毒性作用。在本研究中，3 株蜡样芽孢杆菌可同时降低AFB1、DON 和ZEN 3 种霉菌毒素含量。蜡样芽孢杆菌是可形成芽孢的革兰氏阳性兼性好氧菌，普遍存在于自然界及各类食物中。

3.1 不同芽孢杆菌对玉米籽粒中AFB1的脱毒效果

AFB1 是二氢呋喃氧杂萘邻酮的衍生物，含有一个双呋喃环和一个氧杂萘邻酮，轻微中毒可导致动物免疫机能失常，抑制动物正常生长，降低动物繁殖性能，严重中毒可致其死亡。学者们对芽孢杆菌脱毒机制进行研究发现，芽孢杆菌在生长和繁殖过程中所产生酯肽类化合物和酶类可破坏AFB1 结构的呋喃环和酯肽键，从而达到AFB1 脱毒。发酵时间达到48 h 后，在固定的发酵底物和空间范围内芽孢杆菌的数量到达最大值。有氧发酵过程中，玉米籽粒中霉菌生长繁殖过程产生霉菌毒素，所以在72 h 时所测得霉菌毒素含量较48 h 升高，从而导致霉菌毒素脱毒率降低，这与前人研究结果类似。发酵48 h后，当TD-1 芽孢杆菌的添加量为5%时，对AFB1 的脱毒率最高，为67.59%。刘亚楠等（2021）筛选的一株可降解AFB1枯草芽孢杆菌Q125，在通过不同接种量、发酵时间和发酵温度的研究后得出结论：枯草芽孢杆菌Q125 在pH 为7.5 的初始培养基下，发酵时间38.6 h、接种量5.8%、发酵温度60～80 ℃下，其发酵上清液对AFB1 的脱毒率可达到100%。乔宏兴等（2017）以香豆素为碳源筛选出两个具有毒素脱毒的菌株：枯草芽孢杆菌K-3 和枯草芽孢杆菌K-TM，在优化培养条件时发现培养温度37 ℃和初始pH 为7.0条件下，两株芽孢杆菌对AFB1 的脱毒效果最好，接种量4%的K-3 在48 h 后对AFB1 脱毒率高达88.07%；接种量6%的K-TM 在60 h 后对AFB1 脱毒率为84.81%。

3.2 不同芽孢杆菌对玉米籽粒中DON的脱毒效果

DON是一种主要由禾谷镰刀菌产生的霉菌毒素，对雌性动物的生殖毒性作用与ZEN相似，主要体现在抑制卵巢颗粒细胞和卵母细胞增殖和活力，降低成熟率，干扰孕酮和雌激素合成，引起生殖器官形态和功能异常以及造成胚胎毒性等方面，人和动物若摄入一定量的DON 会出现呕吐、四肢无力等急性中毒症状和脏器损伤、体重下降及免疫功能障碍。有学者研究表明，芽孢杆菌可将DON转化成其他化合物，并通过仔猪饲喂试验，发现脱毒产物不会对猪产生负面影响。在呕吐毒素生物法脱毒中，学者们常筛选出对呕吐毒素具有脱毒作用的微生物，有学者通过从发霉玉米中筛选出蜡样芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌，对呕吐毒素的脱毒率可达73.50%～98.85%。在本试验中，3 株芽孢杆菌菌液添加到玉米籽粒中后，TD-1 芽孢杆菌添加量为5%，发酵48 h 后对DON 脱毒率最高，为73.03%。赖根生等（2021）以苯基环氧乙烷为唯一碳源，筛选DON脱毒菌株，获得高效脱毒菌BL-14，结合形态学和分子生物学方法对该菌株进行鉴定，其16S rDNA 与贝莱斯芽孢杆菌（Bacilus velezensis）相似度达99.43%，该菌在1 μg∕mL的DON浓度下摇瓶发酵16 h对DON 脱毒率达82.63%。Ru 等（2021）研究中，枯草芽孢杆菌ASAG 216 在8 h 内对100 μg∕mL DON 脱毒率可达81.1%。

3.3 不同芽孢杆菌对玉米籽粒中ZEN的脱毒效果

ZEN 是由镰刀菌为主产生的次级代谢产物，具有类雌激素的作用，能够刺激雌性激素分泌，可与雌激素受体结合，发挥雌激素效应，引起卵巢病变，干扰动物排卵等，同时ZEN 还具有免疫毒性、细胞毒性、遗传毒性等。该毒素广泛存在于谷物饲料中，且能够在食物链中积累，对人和动物健康造成巨大危害。在各类饲料原料和饲料产品常见霉菌毒素含量的检测统计中发现，ZEN 的超标率呈逐年上升趋势，在玉米加工产品及宠物饲料中ZEN 的检出率均达到100%。目前国内外相关研究已发现部分真菌及细菌具有ZEN 脱毒能力，真菌主要为酵母属，细菌主要为芽孢杆菌属及假单胞菌属，多数芽孢杆菌属脱毒菌的适宜温度相对较高。段锦等（2021）从青贮饲料、发酵玉米浆、发霉玉米、羊粪便和土壤中筛选出2 株能有效脱毒ZEN 的菌株，分别是解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）及枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），37 ℃培养48 h，对ZEN 脱毒率分别为71.3%和61.5%。从本试验结果中可知，发酵48 h，TD-1 芽孢杆菌10%添加量对ZEN 的脱毒效果最好，脱毒率为65.71%。符浩东等（2022）将ZEN脱毒酶基因在枯草芽孢杆菌中的表达，获得不含抗生素抗性基因的食品级重组枯草芽孢杆菌，将构建重组菌株在37 ℃、pH 7.5条件下培养36 h，结果显示重组菌株表达的脱毒酶对4 μg∕mL ZEN 培养30 min 脱毒率为65.1%。

3.4 毒素降解对玉米籽粒营养成分的影响

霉菌在饲料中生长繁殖需要消耗饲料中营养物质，同时在微生物酶、饲料酶和其他因素作用下，饲料组成成分发生分解，从而导致饲料营养价值严重降低。Teller等（2012）研究发现霉菌污染会导致青贮高粱中淀粉和WSC 含量显著降低。在本试验中，玉米籽粒WSC 含量随着TD-1 菌液添加量增加而减少，这可能与芽孢杆菌及霉菌在增殖过程中对WSC 的消耗有关。崔艺燕等（2022）在柑橘渣中单独添加地衣芽孢杆菌菌液，28 ℃左右有氧发酵7 d 后发现，柑橘渣中WSC含量显著低于对照组，这与试验文中的结果相一致。全株青贮玉米有氧暴露后，粗灰分含量随着有氧暴露时间增加而增加，这与本试验结果中添加菌液对玉米籽粒粗灰分无显著影响不同，具体原因尚不清楚，这可能与添加菌种不同有关。玉米籽粒不同处理组间CP含量在数值上有显著性差异，但差异不大，没有实际生产意义，这可能是样品间差异所导致的。中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量随着菌液添加量变化不显著。有研究报道，在稻秸青贮140 d 开窖后进行有氧暴露过程中，青贮发生变质，霉菌会随之生长，青贮营养品质有所降低；在有氧暴露4 d时，稻草青贮NDF和ADF含量降低。这与本试验研究NDF含量降低，ADF 无显著差异结果不一致，可能是由发酵方式不同所引起。前人报道中，饲料中添加微生物进行脱毒后，营养元素和感官特征仅轻微改变或完全不改变，与本试验结果符合。