非小细胞肺癌组织中miR-217、E2F3的表达变化及其与预后的关系

赵威，周传江

本溪市中心医院胸心外科，辽宁本溪117001

肺癌为全球最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年新增180万肺癌患者，每年有160万人死于肺癌[1]。非小细胞肺癌(NSCLC)是肺癌最常见类型，占肺癌85%以上，尽管近年来靶向治疗被广泛使用，但NSCLC总体存活率仍然较低，且大多数确诊时也进入转移阶段，预后更差，5年存活率仅为16%[2-3]。因此迫切需要了解NSCLC发生驱动因素。微小RNA(miRNA)是一类非编码小RNA，可通过调控癌基因与抑癌基因参与肿瘤发生、侵袭、转移等生物学行为[4]。研究报道，miR-217在多种肿瘤中发挥抑癌基因或促癌基因作用，参与癌细胞增殖、侵袭、转移等过程[5-6]。E2F转录因子3(E2F3)对细胞周期和DNA复制具有重要调控作用，其异常表达与肿瘤发生发展密切相关[7]。目前尚不明确miR-217与NSCLC的关系，且TargetScan数据库预测发现，E2F3可能为miR-217下游靶点。本研究旨在分析NSCLC中miR-217、E2F3表达变化，分析二者与NSCLC临床病理特征和预后的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取我院2014年1月—2015年12月收治的104例接受姑息或根治性切除的NSCLC患者，其中男63例，女41例；年龄38～83(61.54±8.24)岁；吸烟42例；病理分型：腺癌36例，鳞癌68例；肿瘤直径：≥4 cm 51例，<4 cm 53例；分化程度：低未分化43例，中高分化61例；TNM分期[8]：Ⅰ～Ⅱ期58例，Ⅲ～Ⅳ期46例；淋巴结转移36例。纳入标准：经术后病理确诊为NSCLC；初诊且未接受放化疗、手术等治疗；病理资料完整；年龄≥18岁；患者及家属均知情研究；可接受随访。排除标准：合并其他肿瘤；随访资料不全；严重心、肝、肾等脏器疾病；全身感染性疾病；血液系统疾病。本研究经伦理委员会批准。

1.2 组织中miR-217、E2F3 mRNA表达检测 手术切除NSCLC患者部分癌组织和癌旁组织(距离癌组织>5 cm)，剪碎并研磨，TRIzol总RNA抽提试剂盒(北京麦瑞博生物科技有限公司)提取组织中总RNA，取1 μL RNA溶液紫外光分度计检测OD260/OD280和纯度，取5 μL RNA溶液凝胶电泳检测完整性。TaKaRa逆转录试剂盒(上海易汇生物科技有限公司)转录合成cDNA。miR-217正向引物序列：5′-ACACTCCAGCTGGGTACTGCATCAGGAACTG-3′，反向引物序列：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；E2F3 mRNA正向引物序列：5′-GATGGGGTCAGATGGAGAGA-3′，反向引物序列：5′-GAGACACCCTGGCATTGTIT-3′。以U6(正向引物序列：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物序列：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′)为内参，进行实时荧光定量PCR检测。反应体系：10 μL SYBR GreenⅠMaster、1.0 μL正向引物、1.0 μL反向引物、2 μL DNA模板、8.5 μL RNase-Free H2O。反应条件：95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 35 s，72 ℃ 30 s，循环40次。采用2-ΔΔCt法计算组织中miR-217、E2F3 mRNA相对表达量。

1.3 随访 患者出院后通过门诊或电话方式随访5年，随访截至2020年12月，统计患者术后5年总生存率，总生存时间定义为入组至随访截止时间或死亡。

2 结果

2.1 NSCLC癌组织和癌旁组织中miR-217、E2F3 mRNA表达比较 癌组织中miR-217表达低于癌旁组织，E2F3 mRNA表达高于癌旁组织(P均<0.05)。见表1。

表1 NSCLC组织和癌旁组织中miR-217、E2F3 mRNA表达比较

2.2 NSCLC癌组织中miR-217与E2F3 mRNA表达的相关性 Pearson相关性分析显示，NSCLC组织中miR-217与E2F3 mRNA表达呈负相关(r=-0.600，P<0.01)。

2.3 miR-217、E2F3 mRNA表达与NSCLC患者临床病理特征的关系 miR-217、E2F3 mRNA表达与NSCLC患者性别、年龄、是否吸烟、病理分型、肿瘤直径、分化程度无关，与TNM分期、淋巴结转移有关(P均<0.05)。见表2。

表2 miR-217、E2F3 mRNA表达与NSCLC患者临床病理特征的关系

2.4 miR-217、E2F3 mRNA表达与NSCLC患者预后的关系 随访3～60个月，中位49个月，术后5年总生存率为32.69%(34/104)，miR-217高表达(≥0.464，n=57)患者与miR-217低表达(<0.464，n=47)患者术后5年总生存率分别为43.86%(25/57)、19.15%(9/47)；E2F3 mRNA高表达(≥2.613，n=52)患者与E2F3 mRNA低表达(<2.613，n=52)患者术后5年总生存率分别为19.23%(10/52)、46.15%(24/52)。Kaplan-Meier曲线显示，miR-217高表达、E2F3 mRNA低表达患者术后5年总生存率明显高于miR-217低表达、E2F3 mRNA高表达患者(χ2=8.190、7.701，P=0.004、0.006)。见图1。

图1 不同miR-217、E2F3 mRNA表达NSCLC患者的术后3年生存曲线

2.5 NSCLC患者预后不良影响因素的Cox回归分析 以性别(男=1，女=0)、年龄(≥60岁=1，<60岁=0)、吸烟(是=1，否=0)、病理分型(腺癌=1，鳞癌=0)、肿瘤直径(≥4 cm=1，<4 cm=0)、分化程度(低未分化=1，中高分化=0)、TNM分期(Ⅲ～Ⅳ期=1，Ⅰ～Ⅱ期=0)、miR-217(≥0.464=1，<0.464=0)、E2F3 mRNA(≥2.613=1，<2.613=0)为自变量，随访时间为时间变量，预后(死亡=1，存活=0)为因变量。多因素Cox回归分析显示，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴结转移、E2F3 mRNA≥2.613为NSCLC患者预后不良独立危险因素，miR-217≥0.464为独立保护因素(P<0.05)。见表3。

表3 NSCLC患者预后不良影响因素的多因素Cox回归分析

3 讨论

NSCLC是全球范围内一种侵袭性、生长迅速的恶性肿瘤，手术联合化疗和(或)放疗是目前主要治疗方案，但大多患者确诊时已达Ⅲ～Ⅳ期，甚至出现淋巴结转移，术后复发或转移几率高，总体生存率低，本文亦证实TNM分期Ⅲ～Ⅳ期、淋巴结转移为NSCLC预后不良独立风险因素。随着肿瘤分子生物学的进展，近年来出现的以肿瘤特异性分子靶标为基础的靶向疗法(如：表皮生长因子受体、间变性淋巴瘤激酶、受体酪氨酸激酶)和免疫疗法(如：程序性死亡受体1/程序性死亡分子配体1、细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4)，虽然显著延长了NSCLC患生存期，但随着时间的延长，获得性耐药越来越多，因此识别更多治疗靶点具有重大意义[3,9]。

表观遗传改变是恶性肿瘤最大特征之一，其异常改变与肿瘤发生、增殖、迁移、侵袭、耐药等密切相关[10]。miRNA为表观遗传学研究的重要范畴，其是一类长度约22个核苷酸的内源性非编码RNA，可在转录后结合靶基因mRNA的3′非翻译区，导致mRNA降解或抑制mRNA翻译，从而控制靶基因表达。研究表明，人体60%以上的基因表达受miRNA控制，参与调控细胞生长、增殖、分化、能量代谢、周期进展、迁移、凋亡等各种生理过程，在肿瘤发生过程中发挥抑癌或促癌作用[11]。如miR-3180-3p能负向调节叉头盒P4表达抑制NSCLC增殖和转移[12]。miR-218能通过调控核因子-κB信号通路抑制NSCLC中葡萄糖代谢，抑制癌细胞增殖和存活[13]。miR-217定位于2号染色体，近年研究表明，其参与多种恶性肿瘤进展[14-15]。刘丹彤等[14]研究显示，miR-217靶向调控Toll样受体4抑制卵巢癌细胞增殖、迁移和侵袭。JIANG等[15]研究显示，miR-217靶向调控dickkopf-1促进肝细胞癌进展。上述研究表明，miR-217在不同肿瘤中发挥不同作用。本研究结果显示，癌组织中miR-217表达低于癌旁组织，并与TNM分期、淋巴结转移有关，说明miR-217可能在NSCLC中发挥抑癌基因作用。进一步分析显示，miR-217≥0.464患者术后5年总生存率明显提升，为预后不良独立保护因素，说明miR-217低表达参与了NSCLC患者预后不良。但尚不明确其作用机制。沉默信息调节因子2相关酶1可通过调控上皮间质转化、肿瘤相关基因促进NSCLC细胞增殖、侵袭和转移[16]。LI等[17]研究发现，上调NSCLC细胞(A549、H1299)中miR-217表达能抑制NSCLC细胞增殖和入侵，双荧光素酶报告证实miR-217可负向调控沉默信息调节因子2相关酶1发挥抑制增殖、侵袭和促凋亡作用。

肿瘤是一类因正常细胞周期改变而导致的疾病，E2F转录因子家族被证实为细胞周期重要调控环节之一[7]。E2F3位于染色体6p22，不同于其他E2F转录因子家族成员，其具备两个亚基，可通过细胞周期蛋白D1形成二聚体，增强细胞G1/S相转变，促进细胞增殖，阻止凋亡进程[18]。研究显示，肝癌、子宫内膜癌中E2F3表达上调，与癌细胞增殖、迁移、侵袭相关[19-20]。本研究结果显示，NSCLC组织中E2F3 mRNA表达增加，与TNM分期、淋巴结转移有关，同时E2F3 mRNA≥2.613患者术后5年总生存率明显下降，E2F3 mRNA≥2.613为预后不良独立风险因素，与既往研究[21]报道一致。Pearson相关性分析也发现，NSCLC组织中miR-217与E2F3 mRNA表达呈负相关，说明二者可能共同参与影响NSCLC患者预后。YANG等[22]通过TargetScan数据库预测发现，E2F3与miR-217的3′非翻译区存在结合位点，双荧光素酶报告证实miR-217能负向调控E2F3抑制癌细胞增殖并诱导凋亡。上述研究进一步佐证了本研究结果，但关于二者是否共同参与影响NSCLC患者预后还需进一步研究证实。

综上所述，NSCLC组织中miR-217表达下调，E2F3 mRNA表达上调，与TNM分期、淋巴结转移有关，二者可能共同参与影响NSCLC患者预后。但本研究为单中心研究，且关于miR-217对NSCLC的影响机制尚不明确，还需进一步深入研究。