内脂素在PCOS卵巢组织中的表达变化及其对人卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响

曾彬，耿女，于婉莹，王琳，韩宝生

唐山市妇幼保健院生殖医学科，河北唐山06300

多囊卵巢综合征(PCOS)是一种常见的内分泌及代谢紊乱性疾病，是女性不孕的主要原因之一，在育龄期妇女中的发生率为7%～9%[1]。PCOS以慢性排卵障碍、高雄激素血症和双侧多囊卵巢为特征，常伴有胰岛素抵抗、月经紊乱、多毛、痤疮和肥胖。PCOS的发病机制尚未完全阐明，目前研究认为其发病既与遗传因素有关，也与环境因素有关。颗粒细胞是卵巢重要组成部分，在卵泡发育成熟及排卵的过程中起着重要的作用。目前研究认为颗粒细胞的异常增殖凋亡是PCOS患者大量卵泡同时发育的主要病理生理基础[2]。内脂素(visfatin)是近年来发现的一种对机体糖脂代谢有重要作用的脂肪因子，广泛参与调节机体糖脂代谢平衡，调节机体内分泌和能量代谢[3]。近期研究发现，PCOS患者血清和卵泡液中visfatin的表达明显增高，可能参与了PCOS的发生[4]。但visfatin在PCOS发病及进展中的具体机制尚不明确，异常的visfatin水平是否影响卵巢颗粒细胞的正常细胞功能尚不清楚。本研究旨在检测PCOS患者卵巢组织和正常卵巢组织中visfatin mRNA和蛋白的表达变化，并进一步观察visfatin对卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响及可能的机制。

1 材料与方法

1.1 组织标本 2016年1月—2019年12月在我院因PCOS行手术治疗的30例PCOS患者，年龄(30.31±5.19)岁，取手术切除的部分卵巢皮质组织为PCOS组。PCOS患者纳入标准：①PCOS诊断符合2003年鹿特丹会议修订的诊断标准;②不孕并经非手术治疗无效;③子宫输卵管造影术显示无输卵管阻塞；④患者丈夫精液检查未见异常。排除标准：①合并库欣综合征、分泌雄性激素的肿瘤及先天性肾上腺皮质增生等内分泌系统疾病;②术前3个月使用过激素类药物。同期在我院因良性卵巢肿瘤行剥除术的25例患者，年龄(32.45±7.38)岁，取手术切除的部分卵巢皮质组织作为对照组。纳入标准：①年龄小于40岁;②患者内分泌检查正常;③手术时处于卵泡期。排除标准：①患者有不孕史;②术前3个月使用过激素类药物。两组年龄比较差异无统计学意义。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者知情同意。

1.2 主要试剂 TRIzol试剂、Lipofectamine2000转染试剂均购于美国Invitrogen公司；DMEM/F12培养基购于美国Gibco公司；反转录试剂盒、SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒购于日本TaKaRa公司；pcDNA3.1-visfatin表达质粒、pcDNA3.1空载质粒及visfatin引物均购于广州锐博生物技术公司；CCK-8增殖检测试剂盒、Annexin V/FITC凋亡检测试剂盒均购于江苏碧云天生物技术研究所；一抗visfatin、p-PI3K、p-Akt、Bcl-2、Bax、GAPDH及辣根标记的二抗均购于美国Santa Cruz公司。

1.3 细胞培养、转染及细胞分组 人卵巢颗粒细胞KGN购自上海富衡生物科技公司，置于含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基中培养。细胞常规培养，隔日更换新鲜细胞培养液，继续培养细胞待细胞融合度达到80%时使用胰蛋白酶消化收集细胞进行传代，待细胞传至第3代时，取对数增殖期的KGN细胞接种于6孔板(2×105个/孔)。应用Lipofectamine2000转染试剂将pcDNA3.1-visfatin表达质粒或pcDNA3.1空载质粒转染至KGN细胞。根据转染物的不同，转染后的KGN细胞分为pcDNA3.1-visfatin组和pcDNA3.1组。

1.4 visfatin mRNA检测 采用qRT-PCR。TRIzol法提取卵巢皮质组织或KGN细胞总RNA，分光光度仪检测提取的RNA的浓度及纯度。以RNA为模板，采用反转录试剂盒进行反转录合成cDNA，取cDNA和PCR引物，应用SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒进行PCR扩增反应。visfatin引物序列:上游为5′-GCCAGCAGGGAATTTTGTTA-3′，下游为5′-TGATGTGCTGCTTCCAGTTC-3′；内参GAPDH引物序列:上游为5′-TGAACGGGAAGCTCACTG-3′，下游为5′-GCTTCACCACCTTCTTGATG-3′。PCR反应条件：预变性95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，共40个循环。采用2-ΔΔCt法计算visfatin mRNA的相对表达量。

1.5 组织中visfatin蛋白与细胞中p-PI3K、p-Akt、Bcl-2、Bax蛋白检测 采用Western blotting法。取卵巢皮质组织及转染后24 h KGN细胞，加入RIPA裂解液提取组织及细胞总蛋白，BCA法测定提取的蛋白浓度。每组取等量的蛋白样品进行10% SDS-PAGE凝胶电泳分离目的蛋白，转移至PVDF膜后封闭1 h，4 ℃下分别加入一抗visfatin、p-PI3K、p-Akt、Bcl-2、Bax和GAPDH抗体后培养过夜,再加入辣根标记的二抗后室温下孵育1 h，ECL进行显影，应用Image J软件分析条带灰度值。

1.6 细胞增殖活性检测 采用CCK-8实验。收集转染后各组KGN细胞，以4×103个/孔分别接种于96孔板，在恒温培养箱中培养。在转染后的不同时间点(24、48、72 h)，向每孔加10 μL CCK-8溶液，在恒温培养箱中继续避光孵育1 h，采用酶标仪检测各孔450 nm波长下的光密度(OD)值。

1.7 细胞克隆形成能力检测 采用平板克隆形成试验。转染后24 h，取各组KGN细胞，以200个细胞/皿的密度接种到细胞培养皿中，在恒温培养箱中继续培养14 d后取出，PBS洗涤2遍，以4%的多聚甲醛固定细胞15 min，再以0.1%的结晶紫染色20 min，室温下干燥，在高倍显微镜下观察细胞克隆形成情况，计算细胞克隆数(>50个细胞的集落计为1个有效克隆)。

1.8 细胞凋亡率测算 采用流式细胞术。转染后24 h，取各组KGN细胞，将细胞密度调整为1×106个/mL，结合缓冲液悬浮细胞，将100 μL细胞悬液、5 μL PI和5 μL Annexin V/FITC加入流式管中混合均匀，室温下继续孵育15 min，1 h内上流式细胞仪检测各组KGN细胞的凋亡情况。

2 结果

2.1 PCOS组、对照组卵巢组织中visfatin mRNA和蛋白表达比较 见表1。

表1 PCOS组、对照组卵巢组织中visfatin mRNA和蛋白表达比较

2.2 两组KGN细胞中visfatin蛋白表达比较 pcDNA3.1-visfatin组、pcDNA3.1组KGN细胞中visfatin蛋白表达分别为0.82±0.18、0.26±0.09，两组相比差异有统计学意义(t=4.820，P<0.05)。

2.3 两组KGN细胞增殖活性和克隆形成能力比较 pcDNA3.1-visfatin组KGN细胞转染24、48、72 h增殖活性高于pcDNA3.1组KGN细胞(P均<0.05)，见表2。pcDNA3.1-visfatin组、pcDNA3.1组KGN细胞的细胞克隆数分别为(201±39)、(98±26)个，两组相比差异有统计学意义(t=3.801，P<0.05)。

表2 两组KGN细胞增殖活性比较

2.4 两组KGN细胞凋亡率比较 pcDNA3.1-visfatin组、pcDNA3.1组KGN细胞凋亡率分别为(1.9±0.8)%、(9.0±2.1)%，两组相比差异有统计学意义(t=5.472，P<0.05)。

2.5 两组KGN细胞中p-PI3K、p-Akt、Bcl-2、Bax蛋白表达比较 见表3。

表3 两组KGN细胞中p-PI3K、p-Akt、Bcl-2、Bax蛋白表达比较

3 讨论

PCOS是常见于青春期及育龄期女性的内分泌代谢紊乱性疾病，严重影响着女性的身心健康。近年来随着生活节奏的加快、工作压力的增加及人们生活方式的改变，PCOS的临床发病率也呈现逐年增长的趋势，PCOS是女性卵巢功能受损、生育能力下降的主要因素之一[5]。近年来虽然已经尝试应用避孕药、抗雄激素、二甲双胍和克罗米芬等治疗PCOS，但目前PCOS尚无法治愈[6]。

PCOS与卵巢内在性早期卵泡发育异常有关[7]。越来越多的证据表明，卵巢功能受损伴随异常的卵泡生成和类固醇生成，以及优势卵泡发育的缺乏可能是PCOS的主要病理原因。研究发现，在卵泡发育早期，细胞凋亡率较低，增殖率较高，这是导致PCOS患者大量卵泡同时发育而缺乏优势卵泡的主要原因[8]。卵巢颗粒细胞位于卵泡表面，是卵泡生长及闭锁过程中最重要的细胞，通过与卵泡膜的相互作用维持卵巢的正常功能，也是卵泡发育过程中起重要作用的细胞。卵巢卵泡母体信号和微环境主要由颗粒细胞和卵丘细胞调节，调节类固醇生成、卵泡生成以及卵母细胞的生长和成熟[9]。因此，颗粒细胞在正常情况及PCOS中的异常卵泡发生中都起着关键作用[10]。研究认为，颗粒细胞的异常增殖凋亡是PCOS患者大量卵泡同时发育的主要病理生理基础，位于卵泡表面的颗粒细胞增殖凋亡的异常会影响卵泡的发育及成熟甚至导致卵泡闭锁，在PCOS的发病中起着极其重要的作用[11]。

在PCOS的发展过程中，颗粒细胞通常表现为细胞增殖增加和凋亡抑制，并且伴随着细胞存活因子的大量表达增加，造成大量卵泡同时发育[12]。因此，调控卵泡颗粒细胞的增殖或凋亡可能是未来PCOS治疗的方向之一。近年来随着免疫学及分子生物学的快速发展，研究者发现PCOS患者体内尤其是卵巢组织内一些潜在的调节因子的异常可能与颗粒细胞增殖凋亡的异常发生有关，从而参与了PCOS的发病机制。蔡留芸等[13]在研究中发现，PCOS患者血清中Chemerin水平增高，上调卵巢颗粒细胞COV434中Chemerin基因表达后，细胞增殖能力上升，凋亡降低。GENG等[14]发现，PCOS患者卵泡液中miR-99a下调，下调卵巢颗粒细胞COV434中miRNA-99a表达能够促进细胞增殖抑制其凋亡。miR-145被发现对PCOS患者胰岛素受体底物1的表达和卵巢颗粒细胞的增殖具有负调节作用，并且通过有效抑制细胞周期蛋白D和E的表达调节卵巢颗粒细胞的增殖[15]。然而，调控PCOS患者颗粒细胞增殖和凋亡的分子机制至今仍不清楚，仍未发现在其中起着最关键作用的调控因子。

visfatin是近年来发现的一种主要表达于内脏脂肪组织和(或)巨噬细胞的新型脂肪因子，其基因定位于7号染色体q22.1和q31.33之间，能够促进细胞对葡萄糖的摄取及转运过程，在肝脏、骨骼肌中高表达，在机体免疫、炎症反应、氧化应激等方面发挥着重要的作用，广泛参与调节机体糖脂代谢平衡，与机体代谢相关性疾病、肥胖及2型糖尿病等多种疾病相关[16]。近期已有较多研究报道，PCOS患者血清中visfatin的水平增高[17-18]，卵泡液中visfatin的水平也明显增高。虽然有研究认为PCOS患者体内visfatin水平升高可能与机体内胰岛素的抵抗有关，可能是对高胰岛素血症的补偿性反应[19]。但一项纳入1 000多例PCOS患者的meta分析研究结果表明，PCOS患者血清visfatin水平升高，但患者血清中visfatin水平与胰岛素抵抗、BMI及总睾酮比值并无相关性[20]。近期研究发现，visfatin与机体的多种炎症反应有着密切的关系[21-22]。visfatin可以通过影响细胞的能量代谢和炎症反应从而对细胞的增殖、凋亡以及细胞周期产生明显的影响[23]。CURAT等[24]在一项研究中报道，visfatin不仅能由机体脂肪细胞合成，而且还可由脂肪组织中的炎症细胞例如巨噬细胞等合成，表明visfatin可能是一种促炎因子，高表达的visfatin在机体内可能通过促进炎症反应从而影响机体正常的生理活动。而炎性因子能够对卵巢颗粒细胞的增殖、凋亡及分泌功能产生明显的影响[25]。目前visfatin是否影响卵巢颗粒细胞的增殖凋亡以及在PCOS发病中的具体机制均不明确。本研究结果发现，PCOS组卵巢组织中visfatin mRNA的相对表达量高于对照组。为了进一步验证结果，本研究通过Western blotting法检测了卵巢组织中的visfatin蛋白，结果同样显示，PCOS组卵巢组织中visfatin蛋白表达高于对照组，证明visfatin在PCOS组卵巢组织中的表达异常增高，与visfatin在PCOS患者血清和卵泡液中的表达情况一致。

为了进一步明确visfatin表达对卵巢颗粒细胞增殖及凋亡的影响，本研究通过体外细胞学实验，转染visfatin表达质粒至人卵巢颗粒细胞KGN中，通过基因转染技术升高卵巢颗粒细胞中visfatin的表达，建立高表达visfatin的卵巢颗粒细胞模型来观察卵巢颗粒细胞中visfatin异常高表达对KNG细胞增殖活性、克隆形成能力及凋亡的影响。转染visfatin表达质粒后，pcDNA3.1-visfatin组KGN细胞中visfatin蛋白表达较pcDNA3.1组升高，证明visfatin表达质粒转染成功，说明本研究成功构建了异常高表达visfatin的卵巢颗粒细胞模型。CCK-8实验和平板克隆形成实验是目前检测细胞增殖最常用的实验方法。本研究通过CCK-8实验和平板克隆形成实验发现，异常高表达visfatin的pcDNA3.1-visfatin组KGN细胞转染24、48、72 h增殖活性和细胞克隆数均高于pcDNA3.1组，结果提示异常高表达visfatin的卵巢颗粒细胞增殖活性和克隆形成能力明显升高。进一步通过流式细胞术发现，异常高表达visfatin的pcDNA3.1-visfatin组KGN细胞凋亡率低于pcDNA3.1组,并且其抗细胞凋亡蛋白Bcl-2表达升高，而促细胞凋亡蛋白Bax表达降低，提示异常高表达visfatin的卵巢颗粒细胞凋亡明显降低。以上说明PCOS患者机体内升高的visfatin表达能够影响卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡，从而参与PCOS的发病机制。

PI3K/Akt信号传导通路是体内最重要的细胞信号通路之一,是一个能够调控细胞增殖、凋亡最重要的信号通路，在肿瘤、炎症、免疫反应及能量代谢等过程中均发挥重要作用[26]。PI3K被激活后能够催化细胞表面的磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸转换成为3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇，从而激活Akt，进而调控Bcl-2家族凋亡相关蛋白的表达，参与细胞凋亡的调控。研究发现PI3K/Akt信号通路可以参与调控原始卵泡的发育、闭锁、卵母细胞的生长以及卵巢颗粒细胞增殖、凋亡等重要的生理过程，是PCOS发生发展中的重要信号通路[27],也是影响卵巢颗粒细胞增殖凋亡的重要分子通路之一[28]。研究表明，PI3K/Akt信号通路的异常表达会造成卵巢功能的损伤，诱发胰岛素抵抗的风险，并且影响卵泡的增殖。目前较多的研究已经证实，visfatin能够通过活化PI3K/Akt通路参与机体肿瘤细胞增殖、凋亡，肺损伤时细胞凋亡及自噬等重要的生命活动[29]。本研究升高KGN中visfatin表达后，细胞中PI3K/Akt信号通路的关键活性蛋白p-PI3K和p-Akt蛋白表达升高，提示异常高表达visfatin的卵巢颗粒细胞中PI3K/Akt信号通路被激活，visfatin可能能够通过激活PI3K信号通路影响卵巢颗粒细胞的增殖和凋亡，从而参与PCOS的发病机制。

综上所述，visfatin在PCOS卵巢组织中表达升高；visfatin能够促进卵巢颗粒细胞的增殖，抑制细胞凋亡从而参与PCOS的发生发展，其机制可能与其对PI3K信号通路的调控有关。