寻常型银屑病患者外周血miR-155水平变化及其与Th1/Th2平衡的关系

肖艳玲，李东宁，王勤

朝阳市第二医院皮肤科，辽宁朝阳 122000

银屑病是一种免疫相关的慢性复发性炎症性皮肤疾病。寻常型银屑病为银屑病最常见类型，皮损主要表现为斑块状和点滴状，局部或广泛分布，不仅严重影响美观，还可增加心血管疾病风险，严重影响患者生理和心理健康[1-2]。目前研究认为，T淋巴细胞异常活化和浸润介导的免疫功能失调是银屑病重要病理生理特征，其中辅助性T细胞(Th)1/Th2轴可能处于银屑病发生发展的关键环节[3-4]。非编码RNA是一类不编码蛋白质的RNA，研究表明其在先天和获得性免疫系统中发挥重要作用[5-6]。微小RNA(miRNA)-155为miRNA家族重要成员，其在T淋巴细胞的调控中发挥重要作用，已有研究报道其在特应性皮炎、人类免疫缺陷病毒感染、类风湿关节炎等免疫相关疾病中扮演重要角色[7-9]。但miR-155与寻常型银屑病关系尚不明确，基于此，本研究探讨了寻常型银屑病患者外周血miRNA-155水平变化及其与Th1/Th2平衡的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取朝阳市第二医院2019年1月—2020年12月收治的95例寻常型银屑病患者为PV组，其中男53例，女42例；年龄26～62(38.24±5.54)岁；病程4个月～9(4.15±1.08)年。纳入标准：符合《中国银屑病诊疗指南(2018完整版)》[10]寻常型银屑病诊断标准；临床资料完整。排除标准：近两周接受过抗银屑病治疗；合并其他皮肤疾病；妊娠及哺乳期妇女；合并免疫系统疾病；合并严重感染；重要脏器功能损害；体表创伤；严重内科疾病。参照《中国银屑病诊疗指南(2018完整版)》[10]对PV组患者进行分级，包括受累部位和范围、皮损严重程度、生活质量3个方面，分别使用体表受累面积、银屑病皮损面积和严重程度指数、皮肤病生活质量指数评价。轻度：体表受累面积<3%，银屑病皮损面积和严重程度指数<3，皮肤病生活质量指数<6；中度：体表受累面积为3%～<10%，银屑病皮损面积和严重程度指数为3～<10，皮肤病生活质量指数为6～<10；重度：体表受累面积≥10%，银屑病皮损面积和严重程度指数≥10，皮肤病生活质量指数≥10。根据银屑病严重程度分级分为重度组(n=23)、中度组(n=34)、轻度组(n=38)。另选取同期56例体检健康者为对照组，其中男31例，女25例；年龄19～65(37.18±5.47)岁。两组一般资料比较差异无统计学意义。本研究经医院伦理委员会批准，患者及家属均知情同意本研究。

1.2 外周血miR-155和Th1、Th2相关转录因子水平测定 采集PV组入院时和对照组体检时外周血3 mL，EDTA抗凝，TRIzol总RNA抽提试剂(北京普利莱基因技术有限公司)提取外周血总RNA，TaKaRa反转录试剂盒(北京智杰方远科技有限公司)转录合成cDNA，进行qRT-PCR反应。miR-155正向引物序列：5′-ACACTCCAGCTGGGTTAATGCTAATTGTGAT-3′，反向引物序列：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′；T-bet正向引物序列：5′-TGTGACCCAGAGATTGTCT-3′，反向引物序列：5′-TGCGTGTTGGAAGCGTTG-3′；GATA结合蛋白3(GATA3)正向引物序列：5′-CGGCAGGACGAGAAAGAGT-3′，反向引物序列：5′-TAGGGCGGGTAGGTGGTGA-3′。反应体系：10 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ，0.2 μL正向引物，0.2 μL反向引物，0.4 μL ROX Reference Dye Ⅱ，6.0 μL ddH2O；扩增条件：95 ℃ 90 s，95 ℃ 30 s、63 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s共循环40次。以U6和β-actin作内参校正，U6正向引物序列：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向引物序列：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；β-actin正向引物序列：5′-TGCTGTCCCTGTATGCCTCT-3′，反向引物序列：5′-TGATGTCACGCACGATTT-3′。以2-ΔΔCt法计算外周血miR-155、T-bet、GATA3相对表达量。

1.3 外周血Th1、Th2百分比测定 取1 mL抗凝外周血，RPMI1640培养基等体积稀释外周血100 μL，加入10 μL刺激剂，5%浓度二氧化碳培养箱37 ℃孵育4 h。加入CD3-PC5抗体、CD8-PC7抗体，避光孵育15 min。裂解，破膜，加入IL-4-PE抗体、干扰素-γ(INF-γ)-FITC抗体，避光孵育20 min。洗涤后使用赛默飞Attune NxT流式细胞仪检测外周血Th1、Th2百分比，计算Th1/Th2。

1.4 血清Th1、Th2相关细胞因子水平测定 采集PV组入院时和对照组体检时外周血3 mL，3 000 r/min离心10 min(离心半径8cm)。取上清，采用ELISA法(检测试剂盒由上海古朵生物科技有限公司提供)测定IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10。

2 结果

2.1 两组外周血miR-155、Th1、Th2水平和Th1/Th2比较 PV组外周血miR-155、Th1百分比、Th1/Th2高于对照组，Th2百分比低于对照组(P均<0.05)。见表1。

表1 两组外周血miR-155、Th1、Th2水平和Th1/Th2比较

2.2 不同病情严重程度寻常型银屑病患者外周血miR-155、Th1、Th2水平和Th1/Th2比较 重度组外周血miR-155、Th1百分比、Th1/Th2高于中度组、轻度组，Th2百分比低于中度组、轻度组(P均<0.05)；中度组外周血miR-155、Th1百分比、Th1/Th2高于轻度组，Th2百分比低于轻度组(P均<0.05)。见表2。

表2 不同病情严重程度寻常型银屑病患者外周血miR-155、Th1、Th2水平和Th1/Th2比较

2.3 两组外周血Th1、Th2相关转录因子水平比较 PV组外周血T-bet水平高于对照组，GATA3水平低于对照组(P均<0.05)。见表3。

表3 两组外周血Th1、Th2相关转录因子水平比较

2.4 不同病情严重程度寻常型银屑病患者外周血Th1、Th2相关转录因子水平比较 重度组外周血T-bet水平高于中度组、轻度组，GATA3水平低于中度组、轻度组(P均<0.05)；中度组外周血T-bet水平高于轻度组，GATA3水平低于轻度组(P均<0.05)。见表4。

2.5 两组血清Th1、Th2相关细胞因子水平比较PV组血清IFN-γ、IL-2水平高于对照组，IL-4、IL-10水平低于对照组(P均<0.05)。见表5。

表4 不同病情严重程度寻常型银屑病患者外周血Th1、Th2相关转录因子水平比较

表5 两组血清Th1、Th2相关细胞因子水平比较

2.6 不同病情严重程度寻常型银屑病患者血清Th1、Th2相关细胞因子水平比较 重度组血清IFN-γ、IL-2水平高于中度组、轻度组，IL-4、IL-10水平低于中度组、轻度组(P均<0.05)；重度组血清IFN-γ、IL-2水平高于轻度组，IL-4、IL-10水平低于轻度组(P均<0.05)。见表6。

表6 不同病情严重程度寻常型银屑病患者血清Th1、Th2相关细胞因子水平比较

2.7 寻常型银屑病患者外周血miR-155水平与Th1/Th2、T-bet、GATA3的相关性 Pearson相关性分析显示，寻常型银屑病患者外周血miR-155水平与Th1/Th2、T-bet呈正相关(r分别为0.602、0.749，P均<0.05)，与GATA3/β-actin呈负相关(r=-0.585，P<0.05)。

3 讨论

银屑病俗称“牛皮癣”，是临床常见的慢性、复发性皮肤病，目前研究认为其是免疫应答异常、环境诱因、遗传背景等因素相互作用，导致软骨细胞、关节滑膜细胞的炎症反应和(或)角质形成细胞异常增殖，常罹患终身，银屑病相关病理生理机制是目前研究热点[11-12]。T淋巴细胞为机体主要免疫细胞，其在聚集于银屑病皮损前就处于异常活化状态，浸润表皮或真皮层后可促进银屑病进一步发展[3]。成熟的T淋巴细胞能分化为CD4+、CD8+两大亚群，CD4+可分化为Th1、Th2亚群，当Th1/Th2失衡时则会引起银屑病临床表现，因此目前纠正Th1/Th2平衡成为了防治银屑病重要方向[13]。

miRNA是一类长度约22个核苷酸的非编码RNA，通过碱基互补配对的方式与靶基因的3′-非翻译区部分或完全互补，在转录后水平调节基因中发挥作用。研究表明，多种miRNA通过调控Th1/Th2平衡在银屑病发生发展中发挥重要作用，如miR-120、miR-148a-3p[14-15]。miR-155定位于人染色体21q21.3，实验敲除小鼠miR-155基因发现，小鼠树突状细胞的T淋巴细胞、B淋巴细胞功能明显受损，提示miR-155在调控免疫系统和维持免疫平衡中发挥不可或缺的作用[16]。后续BANERJEE等[17]研究证实，miR-155表达上调能促进活化的CD4+向Th1分化，而miR-155表达抑制或缺乏会抑制活化的CD4+向Th0分化，提示miR-155能调控Th的分化，影响T淋巴细胞功能和活化后相关细胞因子产生。近年研究也报道，miR-155参与调控强直性关节炎、哮喘的Th1/Th2平衡[18-19]。本研究结果显示，PV组外周血miR-155水平高于对照组，且轻、中、重度组外周血miR-155水平逐步提升，提示miR-155参与了寻常型银屑病发生发展。

Th1和Th2分别参与细胞与体液免疫，其中Th1能分泌IFN-γ、IL-2、TNF-α，Th2能分泌IL-4、IL-10、IL-13，二者分泌的细胞因子存在相互抑制，因此正常状态下Th1和Th2功能和数量是恒定的，Th1/Th2失衡会导致T淋巴细胞活化，抑制T淋巴细胞免疫应答[20]。本研究结果显示，PV组外周血Th1百分比、Th1/Th2高于对照组，Th2百分比低于对照组，轻、中、重度组外周血Th1百分比、Th1/Th2逐步提升，Th2百分比逐步降低。说明寻常型银屑病患者Th1/Th2平衡明显失调，向Th1方向偏移。同时结果显示，PV组血清IFN-γ、IL-2水平高于对照组，IL-4、IL-10水平低于对照组，轻、中、重度组血清IFN-γ、IL-2水平逐步提升，IL-4、IL-10水平逐步降低，符合Th1/Th2失衡变化，说明Th1/Th2失衡导致了皮肤炎症反应发生发展。既往实验也报道，皮内注射IFN-γ能诱导银屑病样皮损出现，阻断IL-2能抑制T淋巴细胞激活，缓解银屑病炎症反应[21-22]。

T-bet与GATA3分别是Th1和Th2的转录因子，能选择性表达于Th1与Th2，决定Th0的分化方向[23]。本研究结果显示，相比对照组，PV组外周血T-bet水平升高，GATA3水平降低，且轻、中、重度组外周血T-bet、GATA3也存在相应变化，符合Th1与Th2变化。同时寻常型银屑病患者外周血miR-155水平与Th1/Th2、T-bet呈正相关，与GATA3呈负相关，提示miR-155可能通过调节Th1/Th2平衡参与寻常型银屑病发生发展。O′CONNELL等[24]研究显示，miR-155能靶向抑制含SH2区域的肌醇5′磷酸酶1表达，上调T-bet表达，促使T淋巴细胞向Th1方向偏移。彭友华等[25]研究显示，miR-155能靶向抑制GATA3表达，促使T淋巴细胞向Th1方向偏移。进一步说明miR-155可能通过调节Th1/Th2平衡介导寻常型银屑病免疫应答，参与寻常型银屑病发生发展。

综上所述，寻常型银屑病患者外周血miR-155水平高，其可能通过调节Th1/Th2平衡介导免疫应答，参与寻常型银屑病发生发展。