急性STEMI患者外泌体相关基因表达水平与疾病严重程度及预后的关系

王国良 陈 苗 刘莉莉 朱智慧 郭子琰 滕 伟

急性ST段抬高型心肌梗死(ST-segment elevated myocardial infarction，STEMI)指的是由于冠状动脉短时间内缺血缺氧造成的急性心肌细胞坏死，多因心外膜血管闭塞所致[1]。常见的临床表现有剧烈的心前区疼痛，可放射到左上臂和左肩胛部，伴有大汗，舌下含化速效救心丸或硝酸甘油一般不能缓解，疼痛时间超过20 min[2]，若不及时治疗，极易致残、致死。急性心肌梗死患者发作时，常诱发全身器官的变化，伴随一个或多个疾病表现，如心律失常、心力衰竭等，患者发生主要不良心脏事件(major adverse cardiac events，MACE)风险增加[3]。血浆脑钠肽(brain natriuretic peptide，BNP)和氨基末端脑钠肽(amino-terminal pro-brain，NT-proBNP)是目前临床常用的诊断心力衰竭或评估心力衰竭严重程度的指标，但特异性较低[4]。因此，寻找新的、具有较高灵敏度和特异度的标志物具有重要临床意义。多项研究[5-7]报道，核富集转录本1(nuclear-enriched abundant transcript 1，NEAT1)、微小RNA-204(miR-204)、微小RNA-320(miR-320)可能与心肌梗死的发生发展密切相关。因此，本研究以112例STEMI患者为研究对象，探讨外泌体NEAT1、miR-204、miR-320表达水平与急性STEMI患者心衰程度及预后的关系，以期为急性STEMI临床诊疗、评估病情严重程度及预测预后提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年5月至2021年5月在河南大学第一附属医院诊治的急性STEMI患者112例为观察组。Killip分级[8]：Ⅰ级30例，Ⅱ级54例，Ⅲ级28例。另选取同期该院健康体检人群90例为对照组。纳入标准：①符合第9版《内科学》[9]急性STEMI相关诊断标准；②患者及其家属知情同意；③研究通过河南大学第一附属医院伦理委员会批准，批文号20190506。排除标准：①合并严重心动过缓、心肌炎等心血管疾病患者；②合并神经系统、免疫系统疾病患者；③合并严重器质性病变患者；④恶性肿瘤患者。

1.2 主要试剂 exoRNeasy Serum/Plasma Midi Kit试剂盒(北京欣华绿源科技有限公司)、TransScript© All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR 试剂盒和TransScript© miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix 试剂盒(北京全式金生物技术有限公司)、TB Green © Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)试剂盒(广州威佳科技有限公司)。

1.3 引物 以U6为内参，引物由上海生工生物科技有限公司合成。见表1。

表1 NEATE1、miR-204、miR-320引物序列

1.4 外泌体的分离、鉴定及RNA提取 患者入院后第1天采集早晨空腹肘静脉血5 mL，对照组为体检当天采集空腹肘静脉血5 mL，均用促凝真空试管采集，24 h内离心处理(4℃，15 min)后，保留上清液于-70 ℃冰箱中待检测。外泌体分离：将血清样本解冻，使用exoRNeasy Serum/Plasma Midi Ki试剂盒提取外泌体，所有操作严格按照说明书进行。外泌体鉴定：将3 mL外泌体溶液放入150目铜网，静置5 min，去掉外泌体悬液，静置30 s后，染色(2%磷钨酸)5 min，洗去多余磷钨酸，干燥后使用透射电子显微镜观察。外泌体RNA提取：严格按照说明书进行操作。

1.5 总RNA逆转录为cDNA 使用TransScript© All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR试剂盒进行mRNA逆转录，反应体系：总RNA 15 μL、All-in-One SuperMix 4 μL、gDNA Remover 1 μL；使用TransScript© miRNA First-Strand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒进行miRNA逆转录，反应体系：总RNA 9 μL、miRNA RT酶混合物10 μL、2×TS miRNA 反应混合物1 μL，所有操作严格按照说明书进行。

1.6 RT-qPCR试验方法 逆转录定量聚合酶链反应(reverse transcription quantitative PCR, RT-qPCR)采用20 μL反应体系：TB Green © Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(2×)10 μL，cDNA(50 ng/μL)2 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL，ddH2O 6.0 μL。反应条件：94℃、20 s，61℃、30 s，67℃、35 s，40个循环。采用2-△△Ct法对外泌体NEATE1、miR-204、miR-320表达水平进行定量分析。

1.7 观察指标及随访 ①观察指标：收集患者临床资料，包括年龄、性别、合并症、血脂代谢指标[总胆固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、高密度脂蛋白胆固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)]以及住院期间Killip分级。②随访：患者出院后随访3个月，每月通过电话或门诊随访记录患者预后情况，根据患者是否发生MACE分为预后良好组(n=94)和预后不良组(n=18)。

2 结果

2.1 两组对象临床资料比较 两组研究对象年龄、性别、合并症、TC、TG组间差异无统计学意义(P>0.05)；观察组患者HDL-C水平低于对照组(P<0.05)，LDL-C水平高于对照组(P<0.05)。见表2。

表2 两组对象临床资料比较

2.2 两组对象血浆外泌体NEAT1、miR-204、miR-320表达水平比较 观察组外泌体NEAT1、miR-320表达水平高于对照组，miR-204表达水平低于对照组(P<0.05)。见表3。

2.3 不同Killip分级组间外泌体NEAT1、miR-204、miR-320表达水平比较 不同Killip分级间，外泌体NEAT1、miR-204、miR-320表达水平差异有统计学意义(P<0.05)。见表4。

表3 两组对象血浆外泌体NEAT1、miR-204、miR-320表达水平比较

表4 不同Killip分级组间外泌体NEAT1、miR-204、miR-320表达水平比较

2.4 观察组患者血浆外泌体NEAT1、miR-204、miR-320之间的关系 Pearson相关性结果显示，NEAT1表达水平与miR-204表达水平呈负相关(r=-0.191，P=0.042)、与miR-320表达水平呈正相关(r=0.220，P=0.019)，miR-204表达水平与miR-320表达水平无相关性(r=-0.051，P=0.591)。见图1。

图1 NEAT1、miR-204、miR-320相关性散点图

2.5 外泌体NEAT1、miR-204、miR-320表达水平与急性STEMI患者心力衰竭程度的相关性 将Killip分级Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级分别赋值为“1”、“2”、“3”，外泌体NEAT1、miR-204、miR-320表达水平从小到大的顺序编秩，Spearman相关性分析结果显示，急性STEMI患者的外泌体NEAT1、miR-320表达水平与心力衰竭程度呈正相关(rs=0.287、0.456，P<0.05)，miR-204与心力衰竭程度呈负相关(rs=-0.739，P<0.001)。见图2～4。

图2 NEAT1与心力衰竭程度相关性散点图

图3 miR-204与心力衰竭程度相关性散点图

图4 miR-320与心力衰竭程度相关性散点图

2.6 不同预后STEMI患者外泌体NEAT1、miR-204、miR-320表达水平 预后不良组患者的外泌体NEAT1、miR-320表达水平高于预后良好组，miR-204表达水平低于预后良好组(P<0.05)。见表5。

表5 不同预后STEMI患者外泌体NEAT1、miR-204、miR-320表达水平

2.7 外泌体NEAT1、miR-204、miR-320表达水平对急性STEMI患者不良预后的预测价值 以外泌体NEAT1、miR-204、miR-320单独及联合检测作为检验变量，是否发生不良预后作为状态变量进行ROC曲线分析，曲线下面积分别为0.824、0.792、0.801、0.920(P<0.001)；约登指数最大的位置对应的值为截断值，NEAT1、miR-204、miR-320表达水平对应的截断值分别为1.32 copies/mL、0.18 copies/mL、1.10 copies/mL。见图5、表6。

图5 外泌体NEAT1、miR-204、miR-320表达水平预测STEMI患者不良预后的ROC曲线

表6 外泌体NEAT1、miR-204、miR-320表达水平对STEMI患者不良预后的预测价值

3 讨论

据不完全统计，我国每年约54万人死于心肌梗死，其中急性STEMI患者接近50%，急性STEMI合并心力衰竭的发生率高达13%，每年心力衰竭的猝死发生率为20%～30%[10]，故早期预测急性STEMI患者发生心力衰竭的风险具有重要意义。研究[11]报道，除了传统生物标志物外，miRNA和lncRNA等非编码RNA在预测心力衰竭的病情严重程度及评估预后中发挥着重要作用。因此，本研究通过分析急性STEMI患者的病例资料和随访情况，检测外泌体NEAT1、miR-204、miR-320表达水平，探讨其与急性STEMI患者心力衰竭严重程度以及患者预后的关系。

LncRNA已被证明是心血管疾病发生和发展的关键因素[12]，NEAT1是由RNA聚合酶Ⅱ从人类染色体11q13转录而来的长链非编码RNA，有2个转录亚型，分别为NEAT1-1 (3.7 kb)和NEAT1-2 (23 kb)[13]。有研究[14]报道，LncRNA NEAT1可选择性调控Toll样受体2信号通路下游细胞因子白细胞介素-6、趋化因子2等表达。研究[15]发现，心肌缺血早期，心肌组织中Toll样受体2水平迅速上调，促进下游炎症因子合成造成心肌损伤。以上报道表明NEAT1可能是通过调控机体炎症反应参与急性STEMI发生、发展。本研究中，急性STEMI患者NEAT1表达水平随着患者心力衰竭程度增加而增加，同样证实了NEAT1与急性STEMI的病情发展存在一定的关系。

miRNA在细胞内具有多种重要的调节作用，相关研究[16]发现，LncRNA可以间接调控miRNA靶基因的表达。已有研究[17-18]表明，NEAT1通过下调miR-204表达水平调节细胞生物学行为；miR-204可通过抑制细胞自噬，从而减轻心肌炎症，促进心肌细胞再生并抑制细胞凋亡。Yu等[19]的研究发现，miR-204可减轻缺血再灌注对糖尿病模型小鼠心肌细胞的伤害, 减小其心肌梗死面积。本研究中，急性STEMI患者miR-204表达水平随着心力衰竭程度增加而降低；且NEAT1表达水平与miR-204表达水平呈负相关，提示NEAT1可能通过下调miR-204表达水平，抑制miR-204对心肌细胞的保护作用，进而促进急性STEMI病情发展。相关研究[20-21]报道，NEAT1可以作为竞争性内源性RNA负向调控miR-320的表达；下调miR-320可减轻细胞的炎症反应。另有研究[22]发现，在心力衰竭进展期，miR-320过表达加重心肌细胞损伤小鼠的心功能障碍。本研究中， miR-320在急性STEMI患者中随着心力衰竭程度增加而增加，且NEAT1表达水平与miR-320表达水平呈正相关，说明NEAT1可能会上调miR-320表达，促进炎症因子对心肌细胞的损伤，进而促进急性STEMI病情发展。但NEAT1与miR-204、miR-320靶基因的在急性STEMI中的具体调控机制还需进一步采用细胞实验进行分析。

外泌体除了可以修复梗死心肌，由于本身的优势特点促使其可作为急性心肌梗死的潜在生物学标志物[23]。郭俊等[24]的研究发现，LncRNA NEAT1预测心肌梗死发生的AUC为0.884。Chen等[25]发现，miR-204预测急性STEMI发生的AUC为0.743，均有较高的预测价值。本次研究在此基础上探讨了NEAT1、miR-204、miR-320对急性STEMI预后的预测价值，ROC曲线分析显示，外泌体NEAT1、miR-204、miR-320均可作为急性STEMI患者预后的预测指标，AUC分别为0.824、0.792、0.801；联合检测的AUC值为0.920，高于单独检测，可能是由于联合检测提高了灵敏度，进而提高了预测价值。

综上所述，急性STEMI患者血清外泌体NEAT1、miR-320呈现高表达，miR-204低表达，且三项基因联合检测对患者不良预后有一定的预测价值。NEAT1、miR-204、miR-320基因可能是今后控制急性STEMI病情发展的治疗靶点，尤其是NEAT1可能通过调控miR-204、miR-320表达促进急性STEMI病情发展。但本研究仍有一定的局限性，一是样本量相对较小，二是检测指标均为血清样本外泌体指标，只能结合存在的临床资料进行分析，需要进一步采用细胞实验和动物实验进行验证。