乳腺癌患者Lin28A/B水平与乳腺癌转移及血管新生的关系

曹渤海 胡 月 明田莉 杨瑞东

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，近年来发病率逐渐升高，且发病呈年轻化趋势[1]。其具有高侵袭性及易转移、易复发的特点[2]。研究[3]发现，Lin28A/B作为高度保守的RNA结合蛋白，可抑制抑癌基因的合成并促进肿瘤生成。另外，血管新生是肿瘤转移的重要因素[4]，血管新生指标血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、碱性成纤维生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)及血管内皮抑素(endostatin，ES)可以反应血管新生情况，肿瘤细胞的增生促使肿瘤血管新生，血管新生由导致肿瘤转移的概率增大[5]。目前，有关 Lin28A/B在乳腺癌转移中的表达及影响研究较少，为此，本文通过对照研究探讨Lin28A/B在乳腺癌组织中的表达及与乳腺癌转移及血管新生的关系，旨为Lin28A/B对乳腺癌发生和发展的影响，及为寻求控制乳腺癌转移的潜在靶向治疗策略提供一定的参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2019年1月至2020年12月唐山中心医院及滦州市人民医院收治的80例女性乳腺癌患者设为观察组。患者年龄31～70岁，平均(52.25±8.37)岁；绝经47例，未绝经33例；左侧乳腺癌42例，右侧乳腺癌38例；浸润性导管癌49例，导管内癌19例，髓样癌12 例，淋巴结转移37例； TNM分期：Ⅰ期28例、Ⅱ期34例、Ⅲ期18例。乳腺癌诊断参考同时结合患者临床表现、体格检查、影像学检查、组织病理学等进行诊断。观察组纳入标准：①所有患者均为女性且符合《中国抗癌协会乳腺癌诊治指南与规范(2017年版》[6]中乳腺癌诊断标准；②拟行手术治疗者；③术前未行放化疗等治疗；④所有患者对本研究知情同意并签署知情同意书。排除标准：中途转院治疗，脱离实验者。另纳入唐山中心医院同期女性健康体检者40例为对照组，年龄29～68岁，平均(51.36±7.64)岁，绝经24例。对照组纳入标准：于唐山中心医院门诊行乳腺癌筛查未见异常者；排除标准：疑似乳腺癌者。两组对象的性别、年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经伦理委员会批准(批准文号：TZYL/K/2020-14)。

1.2 方法 比较观察组患者癌组织及癌旁组织(距肿瘤边缘5 cm)Lin28A/B的表达，比较观察组与对照组血清癌细胞转移指标基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)、基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)和血管新生指标VEGF、bFGF 及ES表达水平。采用Pearson相关分析癌组织中Lin28A/B mRNA的表达量与癌细胞转移及血管新生指标水平之间的相关性。

1.2.1 实时定量PCR检测Lin28A/B表达 ①收集所有患者术中切除的乳腺癌组织及对应癌旁正常乳腺组织(距肿瘤边缘5 cm)作为检测样本，采集的组织样本均经DEPC水清洗、拭干后，立即放入液氮中，并于-80℃冰箱保存待测。并收集乳腺癌患者入组后和对照组体检当日空腹肘静脉血5 mL，分离血清，置于-80℃冰箱冷冻中待测。②待测样本进行超声匀浆，参照Trizol试剂盒操作说明书[7]提取组织总RNA，DEPC水溶解，应用Nanodrop 2000超微量分光光度计检测总RNA的纯度及浓度，再应用1%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。③参照逆转录试剂盒操作说明书进行逆转录反应，反应体系为20 μL：Oligo dT Primer 1 μL、总RNA 1 μL、dNTP Mixture 1 μL、5×PrimeScript Buffer 4 μL、5×PrimeScript Buffer 0.5 μL、PrimeScript RTase 1 μL，DEPC水补至20 μL。反应条件：30℃ 10 min，42℃ 30 min，95℃ 5 min，产物置于4℃保存待用。④于Thermo Fisher公司购买Trizol试剂盒；于Takara公司购买PrimeScriptTM逆转录酶试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTM实时定量 PCR试剂盒；于Thermo Fisher公司购买Nanodrop 2000超微量分光光度计；于ABI公司购买实时定量PCR仪；参照实时定量 PCR试剂盒操作说明书进行操作，反应体系为25 μL：2×SYBR Premix Ex Taq 12.5 μL,、上下游引物各1 μL、，cDNA模板 2 μL，灭菌蒸馏水补至25 μL。反应条件：95℃ 30 s预变性，95℃ 20 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，40个循环，以GAPDH 作为内参基因。 Lin28A mRNA引物序列：上游引物5’-TGATGCAGTTGGTCGCTGATGGCA-3’，下游引物5’-AGCCCAATGCCCTCTCTGAGGGCCT-3’； Lin28B mRNA引物序列：上游引物5’-ATGCGGAGCTGCAGCACGATACTATG-3’，下游引物5’-CTAGCGCGCTATGTCGACATTGCATG-3’； GAPDH 引物序列：上游引物5’-CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA-3’，下游引物5’-ATGATCTT2GAGGCTGTTGTCATA-3’。本研究采用2-△△CT方法计算目的基因的表达水平，以GAPDH为内参，每组取三个复孔均值，根据各样本的平均Ct 值，以2-ΔΔCt表示目的基因表达水平。

1.2.2 MMP-2、MMP-9检测 采用酶联免疫法检测MMP-2、MMP-9，操作严格按照检测试剂盒(武汉爱博泰克生物科技有限公司)说明书进行。

1.2.3 血管新生指标检测 采用ELISA法检测血管新生指标VEGF、bFGF 及ES，严格按照ELISA法试剂盒(武汉爱博泰克生物科技有限公司)说明书进行操作。

2 结果

2.1 乳腺癌组织及癌旁组织中Lin28A/B mRNA表达量比较 乳腺癌组织中Lin28A/B mRNA的相对表达量分别为(2.57±0.96)、(2.89±0.82)，均明显高于癌旁组织(1.06±0.52)、(1.11±0.69)，差异均有统计学意义(t=12.370、14.856，P均<0.05)。

2.2 观察组与对照组血清癌细胞转移指标水平比较 乳腺癌组血清中MMP-2和MMP-9水平分别为(18.25±3.18)mg/L、(21.91±3.49)mg/L，均明显高于对照组(4.12±1.41)mg/L、(5.99±1.51)mg/L，差异均有统计学意义(t=11.729、21.056，P均<0.05)。

表1 观察组与对照组血清癌细胞转移指标水平比较

2.3 观察组与对照组血清血管新生指标表达水平比较 乳腺癌组血清中VEGF、bFGF和ES的表达水平均明显高于对照组，差异均有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

表2 观察组与对照组血清血管新生指标表达水平比较

2.4 癌组织中Lin28A/B mRNA的表达量与癌细胞转移指标、血管新生指标的相关性 Pearson相关分析显示，乳腺癌组织中Lin28AmRNA的表达量与MMP-2、MMP-9、VEGF、bFGF水平明显相关(r=0.523、0.439、0.562、0.461，P<0.05)，与ES无相关性(P>0.05)；Lin28B mRNA的表达量与MMP-2、MMP-9、VEGF、bFGF明显相关(r=0.546、0.468、0.527、0.449，P<0.05)，与ES无相关性(P>0.05)。见表3。

表3 癌组织中Lin28A/B mRNA的表达量与癌细胞转移指标、血管新生指标相关性

3 讨论

乳腺癌为女性最常见的恶性肿瘤之一，虽然早期乳腺癌患者经手术治疗联合放化疗的治疗效果较好[7]，但临床对于已发生转移的乳腺癌患者而言尚缺乏有效的治疗手段，因此，探寻乳腺癌的早期诊断标记物及有效的治疗靶点对乳腺癌患者的临床诊治意义重大。

Lin28是一种高度保守的RNA结合蛋白，其中Lin28A和Lin28B是主要家族成员[8]，Lin28转录后水平可选择性地阻断miRNA let-7家族的生物合成过程[9-10]，而Let-7可以进一步通过与mRNA的特定序列结合, 诱导mRNA的剪切或阻遏其翻译[11-12]。现已证实Lin28可通过对let-7的抑制作用使let-7下游癌相关基因去抑制，进而促进肿瘤的恶性进程[13]。研究[14-15]发现，Lin28家族在人类原发性肿瘤和肿瘤细胞株中高表达，并可能在肝癌、卵巢癌、白血病等多种肿瘤进展及转移过程中发挥着重要作用。但目前尚不清楚其与乳腺癌转移的关系。本研究结果显示，乳腺癌组织中Lin28A/B mRNA的相对表达水平均明显高于癌旁组织(P<0.05)，提示Lin28A/B mRNA的表达上调可能参与乳腺癌的发生发展，分析原因可能是Lin28在胞浆中诱导let-7家族的尿苷化，从而使其不能被Dicer酶加工，阻断具有抑癌基因功能的let-7的生物合成，产生对靶miRNAs的表达抑制，这与Lin28A/B在其他恶性肿瘤中的报道结果一致，且有研究[16]指出，约15%的恶性肿瘤中存在Lin28的异位表达，其高表达与肿瘤的恶性程度也存在相关关系。

恶性肿瘤的重要临床特征是肿瘤细胞容易侵袭周围组织及发生远处转移，而转移主要是通过血管新生进行转移[17]。MMP被证实是肿瘤转移中的重要参与者，其中MMP-2和MMP-9均是重要成员[18]。新生血管已经被证实为肿瘤细胞的转移通道，其中 VEGF 和bFGF具有极强的促血管新生作用[19]。有研究发现，ES的增高与恶性肿瘤患者远处转移的增加有关[20]。本研究结果显示，乳腺癌组血清中MMP-2和MMP-9的表达水平明显高于对照组，推测MMP-2与MMP-9可能通过降解基底膜的胶原蛋白，从而破坏乳腺局部组织结构，促进肿瘤转移[21-22]，乳腺癌组织中Lin28A/B mRNA的表达量与转移指标MMP-2、MMP-9呈正相关，提示Lin28A/B对乳腺癌患者的促转移有一定影响。乳腺癌组血清中VEGF、bFGF和ES高表达，造成新生血管的生成，为肿瘤生长提供了养分，加速肿瘤细胞繁殖[23-24]。通过Pearson相关分析发现，乳腺癌组织中Lin28A/B mRNA的表达量与转移指标MMP-2、MMP-9及血管新生指标VEGF、bFGF呈正相关，可能与Lin28A/B mRNA激活了目前临床上公认的血管新生通路PI3K/PTEN/Akt中的蛋白出现磷酸化具有一定的关系[25]，其导致其下游促血管因子VEGF、bFGF的高表达，从而参与肿瘤的发展,但这一推测仍需要后续大量实验去证实。

综上所述，Lin28A/B与乳腺癌转移及血管新生关系密切，可能参与调节乳腺癌的疾病进展，下一步将进行深入的基础研究，探索Lin28A/B调节乳腺癌转移及血管生成的具体分子机制，以发现乳腺癌靶向基因治疗的新策略。