稻米中降低血糖血脂以及抗氧化功能的活性成分分析

郭巧玲，杨 莹#，杨小莉，林 郸，强润润，加 峰，张红宇，徐培洲，廖泳祥，王 静，周 浩，刘禹彤，吴先军，陈晓琼*

（1.四川农业大学水稻研究所，成都 611130；2.作物基因资源与遗传改良四川省重点实验室，成都 611130）

近年来随着人们生活水平的不断提高，由饮食习惯引起的慢性病呈上升趋势[1]。其中高血糖可导致糖尿病和代谢紊乱[2]；高血脂导致动脉粥样硬化并引发其他并发症[3]；自由基积累可破坏人体内的生物大分子，引发心血管疾病和癌症[4]。而许多食物具有保健功能，能够有效预防上述慢性疾病，因此通过食物摄取天然的保健成分来控制血糖、血脂和减少自由基的堆积对于提高人们的身体健康具有重要意义。

水稻是我国一半以上人口的主食，是人类日常所需能量的主要来源，水稻中营养成分含量和活性物质含量经常会因品种而异。石尚等[5]对108份水稻品种检测分析，认为水稻黄酮和淀粉含量在不同品种间存在显著差异，从而影响淀粉的品质。叶福新[6]的研究认为不同品种水稻糙米、精米中的氨基酸含量、矿物质和维生素含量呈显著差异。陈凌华等[7]通过对60份水稻品种的抗性淀粉含量与直链淀粉、蛋白含量、胶稠度以及糊化特性等品质的相关性分析，为以抗性淀粉含量为指标的功能性稻米食品的研发和水稻育种提供理论依据。人们日常食用的大米中含有极少量的功能营养成分，但黑米和红米中含有较多的功能营养物质。目前，以黑米和红米作为主栽品种十分缺乏，选育进程缓慢，极大地限制了人们日常饮食中对功能营养成分的摄取，限制了人们对高品质稻米的需求。

稻米根据其果皮颜色分为黑米、红米和白米。黑米和红米由于富含丰富的维生素，大量的微量元素以及类黄酮、花青素等多酚类物质，具有一定的保健功能，如F.Finocchiaro等[8]的研究表明红米中的多酚具有清除自由基和抗氧化的功能；黑米和红米可降低高脂高胆固醇，提高机体抗氧化能力，减少动脉壁细胞及其他成分的氧化损伤[9]；黑米花色苷提取物能够显著降低高脂饮食小鼠的血浆游离脂肪酸和甘油三酯含量，从而降低血脂[10]；红米能提高机体抗氧化能力和防治由氧自由基引起的疾病[11-12]。Chi H.Y.等[13]发现，红米的乙醇提取物能杀死脂肪肝恶性肿瘤细胞系。进一步研究表明，有色米不仅富含维生素、胡萝卜素、黄酮和生物碱等生物活性物质，还富含花色苷，这是普通稻米中所缺乏的。张名位等[14]分析黑米种皮提取物发现其能清除体外活性氧自由基，表现出较强的抗氧化活性。然而作为人类主食的水稻目前营养价值的研究及育种上的利用相对较少，对于不同品种间保健功能的差异研究也不多，可供选择的水稻品种还满足不了人们需求。

我国糖尿病患者逐年增加，医药成本居高不下，通过食品降低或减缓糖尿病的发病率显得尤为重要。作为主食的水稻不同品种间营养成分差异较大，因此研究不同颜色的水稻品种，分析其营养和生理活性物质，对于消费者的饮食取向和以水稻为原料的保健产品的研制具有重要意义。本研究检测了3个不同颜色水稻品种的总的淀粉含量、蛋白含量、抗性淀粉、总的多酚和类黄酮含量，以及抗氧化活性。同时通过小鼠试验，对不同品种的稻米在血糖、血脂和SOD活性方面进行研究，评价稻米的生理功能，为水稻品种的选育和功能稻米的选择提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

SPF级昆明种小鼠，雄性，体重18～22 g，成都达硕生物科技有限公司提供，合格证号：SCXK（川）2013-24。

白米：蜀恢527，由四川农业大学水稻所选育；红米：红香糯，系日本引进；黑米：黑香糯，四川农业大学水稻所提供。

四氧嘧啶（美国Sigma公司A6316-10 g）；盐酸二甲双胍片（中美上海施贵宝制药有限公司）；淀粉检测试剂盒（江苏宝来生物科技）；抗性淀粉检测试剂盒（安诺伦北京生物科技有限公司）；胆固醇检测试剂盒、甘油三酯检测试剂盒、SOD试剂盒（南京建成生物工程研究所）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术）；血糖试纸（德国罗氏诊断有限公司）。

1.2 仪器与设备

W201恒温水浴锅、超声波提取器（上海申顺生物科技有限公司）；RE-5203旋转蒸发器、pH计（上海亚荣生化仪器厂）；UDK169凯式定氮仪（上海人和科学仪器有限公司）；Varioskan Flash酶标仪（赛默飞世尔科技中国有限公司）；SHB-III循环水式多用真空泵（郑州杜甫仪器厂）；ACCU-CHEK Per⁃forma血糖仪（德国罗氏诊断有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 蛋白质、总淀粉和抗性淀粉含量的测定

蛋白质的测定采用凯氏定氮法[15]。准确称取已干燥的试样0.2 g于消解罐中，加入浓硫酸和过氧化氢消解。消解完毕冷却后进行凯式定氮蒸馏，吸收液颜色由蓝色变为灰色为滴定终点，计算蛋白质含量。

总淀粉含量的测定采用蒽酮比色法[16]。在浓硫酸作用下，糖脱水生成糠醛，再进一步脱水形成环后，形成糠醛衍生物，与蒽酮脱水缩合形成蓝绿色化合物。该化合物在620 nm处有最大吸收峰。

抗性淀粉的含量按Megazyme抗性淀粉试剂盒说明测定[17]。加入胰 α-淀粉酶（10 mg/mL）和AGM(3 IU/mL）的混合工作溶液，放置于37℃水浴摇床中孵育16 h，用GOPOD试剂在分光光度计波长510 nm处测定吸光值，并计算出各样品抗性淀粉含量。

1.3.2 多酚、黄酮和抗氧化能力的测定

多酚含量的测定采用福林酚法[18]。在20 mL具塞试管中，分别加入不同体积的10 mg/100mL没食子酸标准溶液和3 mL福林酚试剂，7～8 min后加入3 mL 10% Na2CO3溶液，摇匀，于25℃静置反应l h，用水定容至20 mL，测定OD760nm。

黄酮的测定采用NaNO2-Al(NO)3比色法[19]。精密量取供试品溶液1 mL，置25 mL量瓶中，加水至6 mL，加5% NaNO2溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加10% Al(NO3)3·9H2O溶液1 mL，摇匀，放置6 min，加NaOH试液10 mL，加水至刻度，摇匀，放置15 min。以相应的试剂为空白，立即在503 nm处测定吸光度。

抗氧化能力的测定采用ORAC法[20]。以水溶性维生素 E(6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，Trolox)作为参照，具体方法如下：向96孔板中加入样品后放入酶标仪中，温育后加入荧光素钠工作液，混匀温育20 min后加入AAPH溶液，以激发波长490 nm、发射波长530 nm连续测定荧光强度。计算空白和每个样品之间的荧光素衰减曲线下的面积（净面积）的差值。

1.3.3 样品制备

采用郭红辉等[21]的方法提取稻米，制备技术路线如下：大米样品→乙醇浸提（浸提3次，每次12 h）→浓缩→脱脂→树脂分离→乙醇洗脱→浓缩→干燥。

1.3.4 糖尿病小鼠造模

参照黄桂红、陈红艳等[22-23]方法对糖尿病小鼠进行造模：随机选取小鼠20只，随机分为5组，每组4只，各组小鼠禁食（不禁水）12 h后，分别腹腔一次性注射新配制的2%四氧嘧啶溶液造模，剂量分别为200、220、250、280和300 mg/kg，造模后小鼠恢复进食；于造模48 h后小鼠再次禁食（不禁水）12 h后，断尾尖取血，用血糖仪测定血糖值，测定结果大于11.1 mmol/L的小鼠为合格的四氧嘧啶糖尿病模型小鼠。结果显示，造模剂量为280 mg/kg组别的小鼠成模率75%，较其他组高，所以选择280 mg/kg造模剂量进行正式试验。

1.3.5 糖尿病小鼠血糖、血脂及抗氧化能力的测定

小鼠在成都中医药大学药学院实验动物观察室[许可证号：SYXK（川）2014-124]内饲养。随机选取小鼠117只，按照预试方法进行造模，选取合格的四氧嘧啶糖尿病模型小鼠84只，随机分为5组，分别为3个大米受试样品组：白米组、红米组和黑米组（给药剂量均为6 g/kg）、阳性对照组按黄键等[24]方式制备、模型对照组（灌纯水），另设一正常小鼠的空白对照组。6组小鼠每日上午九点灌胃一次，连续灌胃给药5、10、15和19 d给药后禁食不禁水12 h断尾尖取血，血糖仪测定血糖值。给药19 d测定血糖后，小鼠摘眼球取血，3 500 r/min离心10 min分离血清，按甘油三酯和总胆固醇试剂盒说明测定血清TG和TC含量，并取肝脏称重，计算肝脏指数，制备肝组织匀浆，测定肝组织SOD水平。

1.4 统计分析

采用SPSS 17.0对试验数据进行分析。计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，采用方差分析，多组间两两比较采用LSD-t检验。以P<0.05为差异，具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 不同颜色稻米的蛋白质和淀粉含量比较

本试验选取3个不同颜色的水稻籽粒，且在外形和颜色上存在明显差异（图1）。为了确定大米中蛋白质和淀粉含量是否会影响其功能，本研究首先分析3个水稻品种的主要营养品质，包括蛋白和淀粉含量（图2）。为了确定3个不同颜色稻米中蛋白质与淀粉含量的差别，我们采用凯氏定氮法[15]和蒽酮比色法[16]进行检测，结果发现3种大米的蛋白质含量维持在6.5%～7.1%之间，黑米的蛋白质含量相比蜀恢527高0.6%，且差异显著。本研究中的3个大米品种总淀粉含量在65%～75%之间，无显著差异。以上结果表明，3个不同颜色的稻米品种间总的淀粉和蛋白含量差异与稻米颜色之间不存在相关性。

图1 3种品种大米的颜色比较Figure 1 Comparison of the color of three rice varieties

图2 3个品种大米的蛋白质和淀粉含量Figure 2 The content of protein and starch in three different rice varieties

2.2 不同颜色稻米的多酚和类黄酮含量比较

由于3个水稻品种呈现不同的颜色，为了进一步了解其多酚和类黄酮含量是否存在差异。本研究对3种颜色大米的多酚和类黄酮含量进行检测以确定含量的差异，结果表明红米红香糯的多酚含量最高为12.6 mg/g，其次是黑米黑香糯，最低的是白米蜀恢527，仅5.6 mg/g。类黄酮含量结果正如总的多酚含量，最高的为红米红香糯（3.6 mg/g），是白米蜀恢527的6倍高。更进一步分析发现，不同大米中的类黄酮含量变幅为0.6～3.6 mg/g，变异系数为68.8%。

图3 3个品种大米的多酚和类黄酮含量Figure 3 The content of polyphenols and flavonoid in three different rice varieties

2.3 抗氧化和抗性淀粉分析

大量的研究表明，类黄酮和多酚具有很强的抗氧化性，因此本研究分析不同品种的抗氧化能力。结果表明，不同品种大米的抗氧化活性值（ORAC）范围为107～363 μmol/g，其中红米红香糯的ORAC值最高，其次是黑米黑香糯219 μmol/g，白米蜀恢527值最低，仅107 μmol/g。

3个材料中抗性淀粉含量进行检测，结果表明3个大米品种的抗性淀粉含量范围为1.16%～1.37%，黑米黑香糯含量最高，白米蜀恢527的抗性淀粉含量次之，红米红香糯的含量最少，三者间无显著差异。

图4 3个不同稻米品种的ORAC值和抗性淀粉含量Figure 4 The content of ORAC and resistant starch in three different rice varieties.

2.4 动物试验

根据淀粉和抗性淀粉含量以及蛋白含量分析，发现3个不同品种之间不存在显著差异，但是总的多酚和类黄酮含量存在极显著差异，抗氧化试验表明，类黄酮和多酚含量越高，其抗氧化活性越强。有研究表明部分糖尿病患者与体内自由基的过量堆积有关，而多酚和类黄酮具有清除自由基活性[25]。因此，本研究接下来通过喂食糖尿病小鼠，检测糖尿病小鼠的血糖血脂变化，分析不同颜色稻米效应成分的生理功能。

2.4.1 大米提取物对小鼠体重的影响

采用郭红辉等[21]的方法提取稻米后，将小鼠分为6组，喂食19 d，结果发现：在19 d试验进程中，各组试验小鼠随着饲养时间的延长，体重无显著变化。各组小鼠的体重均值维持在28～34 g之间，空白组小鼠体重均值为34.4 g，其余各处理组小鼠体重维持在28 g左右，处理组间无显著差异，各处理组相比空白组略有降低，符合糖尿病小鼠体重降低的表型特征（图5）。

图5 小鼠在不同喂养时间以及不同处理组中的体重Figure 5 Weight of mices in different administration time to different groups dealt

2.4.2 大米提取物对糖尿病小鼠血糖的影响

本研究对糖尿病小鼠的血糖变化进行测定，结果见表1，给药前，糖尿病模型小鼠的血糖均值为23.19 mmol/L，空白组的血糖均值维持在5.31 mmol/L，模型组相比空白组的血糖值有显著性升高，表明造模成功。在给药后的第5天，红米红香糯组糖尿病小鼠的血糖值为17.42 mmol/L，比给药前降低了5.76 mmol/L，在继续喂养到第19天，血糖值仍然降低了4.07 mmol/L。药物二甲双胍组也表现出显著的降糖效应，到第19天，与给药前相比，血糖值降低了4.92 mmol/L。与红米组相比，白米蜀恢527组和黑米黑香糯组血糖值分别为20.86、20.17 mmol/L，与给药时相比无明显的降糖效应。

表1 大米提取物对糖尿病模型小鼠血糖浓度的影响Table 1 Effect of rice extract on the blood glucose concentration in alloxan diabetic model mice

2.4.3 大米提取物对糖尿病小鼠血脂的影响

本研究对糖尿病小鼠的血脂变化进行测定，结果表明，模型组的TC值和TG值分别为3.47和1.18 mmol/L，大米提取物黑米黑香糯组小鼠的血清TC含量维持在2.93 mmol/L水平，TG含量维持在1.09 mmol/L水平，其次是红米红香糯组，TC和TG分别是3.26 mmol/L和1.33 mmol/L，与模型组相比黑米黑香糯组有降低趋势，但是白米蜀恢527组小鼠的TC、TG值分别为3.47、1.18 mmol/L，与模型组相比没有降低TC和TG的功效（表2）。

表2 大米提取物对糖尿病模型小鼠血脂水平的影响Table 2 Effect of rice extracts on the blood lipid levels in alloxan diabetic model mice

2.4.4 大米提取物对糖尿病小鼠SOD活性的影响

对糖尿病小鼠的SOD活性进行测定，结果表明，红米红香糯组小鼠的SOD值最高，达到556.65 U/mg黑米黑香糯组的SOD值次之维持在515.97 U/mg，而白米蜀恢527组最低只有485.25 U/mg（P<0.05），表明红米提取物的SOD活性最强（表3）。

表3 大米提取物对糖尿病模型小鼠肝组织SOD水平与肝脏指数的影响Table 3 Effect of rice extracts on liver tissue SOD level and liver index in model mice

3 讨论与结论

本研究对3种不同颜色稻米的蛋白质、淀粉及抗性淀粉含量进行检测，发现不同颜色稻米之间无显著差异，而稻米提取物中总的多酚和类黄酮含量存在显著差异。为了分析多酚和类黄酮是否具有降低血糖效应，本研究更进一步通过小鼠试验研究其生理功能。结果表明红米红香糯提取物对降低糖尿病小鼠的血糖水平效果显著，与前人研究结果一致。马静等[26]以白米作为参照标准，同样发现红米有利于降低血糖水平；此外，周林秀等[27]探讨不同稻米品种对糖尿病大鼠餐后血糖的影响，结果也表明具有较低的血糖指数的是红米品种。但R.Sasaki和S.Nasri等[28-29]的研究则发现黑米具有降低血糖的功效。不同水稻品种多酚和类黄酮含量存在差异。如邵雅芳[30]的研究表明完熟期黑米中多酚含量显著高于红米和白米，而周夏[31]的研究表明红米中的多酚含量高于黑米和白米，沈芸[32]的研究发现白米、红米和黑米的类黄酮成分依次递增，且红米降低血糖的功效归结于多酚类物质，其中黄酮、花青素、甾醇和生物碱等生物活性物质是主要的功能成分，通过抑制肠道消化酶类，加快机体葡萄糖利用速度，达到降血糖效果。Yan F.J.等[25]研究表明类黄酮和多酚通过清除过量活性氧自由基从而达到降低糖尿病患者的血糖水平。本试验中，红米红香糯中多酚和类黄酮含量最高，与动物试验大米提取物降糖结果成正相关趋势。本研究更进一步证实多酚和类黄酮通过清除过量活性氧自由基，从而达到预防或降低糖尿病患者的血糖水平。

通过动物血脂试验表明，黑香糯提取物对糖尿病小鼠的降血脂的能力最强。黑香糯是一种黑米，这与T.Tsuda等[33]研究结果相似，花色苷类化合物矢车菊素-3-葡萄糖苷对高脂肪引起肥胖症状具有明显的缓解效果；对载脂蛋白基因缺陷小鼠饲喂花色苷提取物，能降低小鼠血清中血脂含量[34]；用黑米花色苷提取物喂养高血脂小鼠，小鼠血脂水平有所降低，证实了类黄酮和花色苷等提取物具有调节血脂的功能[35]。前人的研究显示黑米中的花色素主要包括矢车菊-3-葡萄糖苷、矢车菊-3，5-二葡萄糖苷、天竺葵-3，5-二葡萄糖苷、锦葵素等化合物，通过抑制胰腺脂肪酶活性、降低胆固醇在胶束中的溶解度和抑制体外肠细胞胆固醇摄取而降低胆固醇吸收[36]。但本试验提取物为整个颖果，并未分析提取具体的有效成分，因此后续试验可以结合代谢组学分析具体降血脂的成分及其机制。

通过体内和体外的抗氧化分析，结果表明红米红香糯提取物的抗氧化能力最强，黑米黑香糯提取物次之，白米蜀恢527提取物最低。红香糯和黑香糯是有色稻米，目前有大量关于稻米抗氧化能力的报道，但是不同的报道具有不同的结论。Yao Y.和T.Laokuldilok等[37-38]认为黑米的抗氧化能力优于红米。朱晓莉[39]报道称黑米中的花色苷是清除活性氧的主要贡献者。而Chen X.Q.等[40]试验结果显示花青素对颖果抗氧化能力的贡献较低，除花青素以外的酚类化合物可能影响自由基清除活性。T.Rus⁃kovska等[41]也曾报告多酚有助于自由基清除。有色米中多酚类物质的种类很多，如各种花青素、阿魏酸、儿茶素、香兰素酸以及ρ-香豆酸等。不同的品种含有的多酚比例和种类不同。例如，R.Sompong等[42]发现红米品种中最丰富的酚酸是阿魏酸，其次是ρ-香豆酸和香兰素酸。黑米品种中最常见的是阿魏酸，其次是香兰素酸和ρ-香豆酸。因此，红米红香糯与黑米黑香糯相比抗氧化能力的差异可能是由于所含多酚的类型以及比例不同，后续需要进一步研究不同酚类化合物的抗氧化能力，并确定其结构和抗氧化能力的关系。