日粮精粗比对青海黑藏羊小肠营养物质转运载体基因表达水平的影响

周 力，张峰硕，张春梅，杨葆春，桂林生*，王志有*

（1.青海大学农牧学院，西宁 810016；2.宁夏大学农学院，银川 750021）

反刍动物对小肽、氨基酸和单糖的吸收起始于小肠，并由小肠上皮细胞中相应的营养物质载体转运到血液循环供应机体新陈代谢的需要。小肠主要由十二指肠、空肠和回肠组成，虽然不同区段小肠组织形态学的特征较为相近，但对营养素分子的消化吸收能力却有所不同[1]。小肠消化吸收能力主要取决于其组织形态发育、转运载体的数量以及活性等[2]。

适宜的营养物质摄入水平不仅可以促进小肠的生长发育[3]，同时还能调节相应营养物质转运载体的表达量来促进对氨基酸与小肽的转运[4]。小肽转运载体1（Peptide transporter 1,PEPT1）基因主要在小肠中高度表达，在小肽的吸收过程中起着关键作用[5]。钠-葡萄糖转运蛋白 1（Sodium-dependent glucose transporters 1,SGLT1）不仅在葡萄糖的吸收方面发挥着重要作用，还能参与细胞自救，防止细胞凋亡等[6-7]。葡萄糖转运蛋白（Glucose transporter,GLUTs）作为哺乳动物细胞葡萄糖转运的主要载体，其中以葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）在机体内的分布最为广泛[8]。蛋白质酪氨酸激酶2（Januskinase 2,JAK2）主要负责参与细胞增殖、分化、凋亡以及免疫调节等生物学过程[9]。迄今为止，尚未发现有关黑藏羊肠道营养物质转运载体相关基因mRNA表达规律研究的报道，一定程度上制约了肉羊产业向集约化、现代化方向发展。黑藏羊作为藏羊品种中一个重要的经济类群，同时也是宝贵的高原种质资源，具有体格强健、繁殖性能好以及生长发育快等特点，肉质以高蛋白、低脂肪、营养价值全面以及微量元素丰富等而深受消费者青睐[10]。因此，研究黑藏羊肠道组织中PEPT1、SGLT1、GLUT1及JAK2基因的mRNA表达模式对于了解营养物质吸收以及推动青海特色畜牧业的发展都具有重要意义。

为此，本试验拟以平均海拔3 100 m地区的青海贵南黑藏羊作为试验对象，通过对比小肠组织中营养物质转运载体相关基因mRNA表达水平的差异，有助于进一步了解小肠对氨基酸、小肽以及葡萄糖等营养物质吸收的分子机理，可为今后生产实践中有关绵羊营养调控提供理论依据和数据支撑。

1 材料和方法

1.1 试验设计

试验选用发育良好、体重（10.45±0.96）kg相近的青海贵南黑藏羊公羔60只，按完全随机区组设计分为3组，每组20只，单栏饲养。分别饲喂70%精料补充料+30%粗料（HC组）、50%精料补充料+50%粗料（MC组）和30%精料补充料+70%粗料（LC组）的基础日粮。试验共计128 d，其中预试期8 d，正试期120d。日粮配方参考中国《肉羊饲养标准》（NY/T 816-2004）进行配制[11]，具体配方组成见表1。粗饲料由燕麦青贮和燕麦青干草按干物质各占1/2组成。试验期间每天08:00和17:30将精料与粗料搅拌均匀后饲喂2次，自由采食和自由饮水，其他饲养管理按照羊场的规定严格执行。

表1 饲料配方组成及营养水平（干物质基础）Table 1 Feed formula composition and nutritional level（dry matter basis）

1.2 样品采集

试验结束时，每组中随机选取5只试验羊在禁食12 h、禁水2 h后按照颈静脉放血方式进行屠宰，屠宰1 h内沿纵向剖开腹腔，准确找到十二指肠、空肠和回肠的黏膜层组织，剪开肠段，然后用4℃预冷的无菌生理盐水将内容物冲洗掉，分别装入1.5 mL离心管中，经液氮速冻后带回实验室移到-80℃冰箱保存待检。

1.3 试验方法

1.3.1 总RNA的提取及检测

按照Trizol法提取动物组织中总RNA，采用超微量核酸蛋白测定仪测定的总RNA浓度和纯度A260 nm/A280 nm）。根据1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测提取的总RNA的完整性，根据5 S rRNA、18 S rRNA和28 S rRNA的亮度判断样品RNA是否存在降解现象。

以黑藏羊肠道不同区段的cDNA为模板，在罗氏LightCyler 480Ⅱ实时荧光定量PCR仪上进行反应。反应体系：正、反向引物（50 μmol/L）各0.1 μL，cDNA 模板 2 μL，2×SYBR Green qPCR Master Mix 5 μL，RNase free ddH2O 4.8 μL。反应条件:95 ℃10 min,95℃15 s,60℃30 s,循环数为40。

1.3.2 cDNA合成

常规组患者予以常规的治疗,主要针对患者禁食严格控制,实施腹腔引流,减轻患者肠胃负担,并对患者予以肠胃营养供给。观察组患者则予以手术治疗,针对患者粘连和感染程度确定手术方案,并加强患者术后切口的护理和感染预防工作。患者在治疗期间予以优质、综合性和针对性的护理方案,提高患者治疗效果。

总RNA经质检合格后，使用第一链cDNA Syn⁃thesis Kit试剂盒进行反转录。试验在冰上进行，取RNase free ddH2O、5×RT Buffer、RT Enzyme Mix、dNTPs（10 mmol/L,each）、Oligo（dT）15（50 μmol/L）、Random hexamers（50 μmol/L）和 模 板 RNA 组 成50 μL反应体系，具体操作步骤按照反转录试剂盒说明书进行，将所得cDNA保存于-20℃冰箱待测。

根据GenBank中的基因序列，通过Primer 6.0软件设计PCR引物，引物序列由上海生工进行合成。引物序列、产物长度及退火温度如表2所示。以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）作为内参基因，以PEPT1、SGLT1、GLUT1和JAK2作为目的基因进行相对定量分析。

1.3.3 引物序列及合成

通过函数调用，将上市公司全称与境外投资企业名称进行精确匹配；处理上市公司名称，删除 “集团”、“股份”、“控股”、“有限”、“公司”等字样，再一次进行模糊匹配；进一步利用关联交易文件确定上市公司与对外直接投资企业间是否存在关联关系。本文认为其母子公司或同一集团控股子公司间接参与对外直接投资活动，符合本文研究上市公司对外直接投资活动对整个企业集团绩效影响的初衷。

表2 引物信息Table 2 Primer Information

黑藏羊十二指肠基因相对表达量结果如图3所示。HC组十二指肠的PEPT1基因mRNA相对表达量显著高于LC组（P<0.05），较MC组差异不显著（P>0.05）。MC组和LC组十二指肠的SGLT1和GLUT1基因mRNA相对表达量极显著低于HC组（P<0.01），而MC组与LC组间差异极不显著（P>0.01）。不同组间十二指肠的JAK2基因mRNA相对表达量差异不显著（P>0.05）。

四个月以前，楚墨再一次遇到静秋。三个月以前，楚墨给了静秋一个结实的拥抱。两个月以前，楚墨对静秋说，他仍然爱她，像大学时候一样爱她。一个月以前，楚墨将静秋拥到怀里深吻。两个人天真地认为他们都会守住最后的底线，然而，在对方的身体面前，他们不堪一击。

各样品引物PCR扩增的Ct由各自的扩增曲线分别得出，采用2-ΔΔCt法[12]计算目的基因的mRNA相对表达丰度，并通过GraphPad Prism 7.0软件进行绘图，试验结果以“平均数±标准差（mean±SD）”表示，以P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

1.4 数据统计与分析

(1)(2)中的这些恒等式就是3阶幻方中常见的一次恒等式了.接下来，我们就要以这些一次恒等式为基础建立二次、三次恒等式.

[3]陆张维,徐丽华,等.基于GIS的中心城区建设用地适宜性评价-以浙江省杭州市为例[J].江苏农业科学,2016(6):488-492.

2 结果与分析

2.1 总RNA质量及反转录效果

GAPDH、PEPT1、SGLT1、GLUT1及JAK2基因实时荧光定量PCR扩增产物的电泳结果如图2所示。根据表2给出的产物大小对应相应条带进行判定，即为目的基因扩增产物。

图1 试验总RNA凝胶电泳图Figure 1 Total RNA gel electrophoresis

2.2 实时荧光定量PCR电泳图

经检测发现黑藏羊十二指肠、空肠和回肠的总RNA浓度均在1.8～2.0之间，样品质量符合后续试验条件。通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测（见图1），发现提取的未降解RNA样品可见清晰28S、18S，且亮度比基本为2:1。说明所提取的RNA纯度较高，质量较为可靠。

根据E· 杰克逊· 鲍尔于1960年提出的舆论形成的七个步骤，江苏卫视《非诚勿扰》的舆论形成过程可分为如下几步：(1)来自社会各界的男女嘉宾秉持着共同的目标——寻找异性伴侣，来到江苏卫视《非诚勿扰》的舞台；(2)舞台上，男女嘉宾提出各自观点，产生冲突、争论；(3)主持人从中调和，专家做出分析；(4)主持人做出总结，可作为节目制播方的权威性决定，形成场内舆论；(5)舆论话题延伸到场外，形成场外舆论，持续时间长；(6)场内舆论和场外舆论相结合，形成《非诚勿扰》舆论网络。如图3。

图2 实时荧光定量PCR电泳图Figure 2 Real-time quantitative PCR electrophoresis

2.3 黑藏羊小肠组织PEPT1、SGLT1、GLUT1和JAK2基因的mRNA相对表达丰度

1.3.4 RT-qPCR反应体系和程序

图3 黑藏羊十二指肠中营养物质转运载体基因的mRNA相对含量Figure 3 mRNA relative content of nutrient transporter gene in duodenum of black Tibetan sheep

黑藏羊空肠基因相对表达量结果如图4所示。各组间空肠的PEPT1基因mRNA相对表达量表现为：HC组>LC>MC，但均差异不显著（P>0.05）。HC组空肠的SGLT1基因mRNA相对表达量极显著高于MC组和LC组（P<0.01），而MC组和LC组间差异极不显著（P>0.01）。MC和LC组空肠的GLUT1基因mRNA相对表达量极显著低于HC组（P<0.01），同时MC组和LC组间差异显著（P<0.05）。各组间空肠的JAK2基因mRNA相对表达量差异不显著（P>0.05）。

图4 黑藏羊空肠中营养物质转运载体基因的mRNA相对含量Figure 4 mRNA relative content of nutrient transporter gene in jejunum of black Tibetan sheep

黑藏羊回肠基因相对表达量结果如图5所示。MC组与LC组回肠的PEPT1基因mRNA相对表达量极显著低于HC组（P<0.01），同时MC组与LC组间差异极不显著（P>0.01）。HC组回肠的SGLT1和JAK2基因相对表达量均高于MC组与LC组，其中HC组和MC组间差异达到显著水平（P<0.05）。各组间GLUT1基因相对表达量差异不显著（P>0.05）

图5 黑藏羊回肠中营养物质转运载体基因的mRNA相对含量Figure 5 mRNA relative content of nutrient transporter gene in ileum of black Tibetan sheep

3 讨论与结论

幼龄时期处于反刍动物生命周期中的关键阶段，在此期间，必须高度重视能量、蛋白质含量以及比例的供给情况，会直接影响到机体今后的生长发育状况[13]。机体的生长发育不仅取决于的营养物质摄入量，而且和小肠消化吸收的能力息息相关[14]。据报道，小肠上皮细胞营养物质转运载体的表达量能够直接影响养分的吸收[15]，所以反刍动物消化吸收的能力可以通过小肠运载体基因表达丰度来反映。目前关于日粮组成与反刍动物肠道相关基因表达量的研究报道相对较少，因此，研究日粮精粗比对黑藏羊肠道营养物质转运载体基因表达量的影响，对于改善绵羊生长发育具有重要意义。

小肽转运载体1（PEPT1）在肠道内参与小肽的吸收[16]，同时对氨基酸转运以及机体免疫也存在一定影响[17]。以肉鸡为研究对象[18]，发现蛋白水平为18%组与24%组肠道PEPT1基因mRNA的表达丰度显著高于蛋白水平为12%组。唐德富等[19]试验表明，16%蛋白组十二指肠和空肠PEPT1基因mRNA的表达量显著低于20%蛋白组，同时其空肠的表达量显著低于18%蛋白组。其他试验也进一步证实，精粗比为75∶25饲粮的荷斯坦犊牛十二指肠、空肠PEPT1基因mRNA的表达丰度极显著高于精粗比为65∶35饲粮[20]。上述研究结论与本试验结果类似，本试验中，HC组十二指肠、空肠及回肠PEPT1基因表达量均高于其他2组，其中十二指肠、回肠差异显著或极显著。其原因可能是：首先提高精料量的使得内源消化蛋白质的酶量随之相应增加，促进了肠道载体的表达[21]，其次蛋白质的分解产物（如氨基酸、小肽和单糖等）对载体的表达具有调节作用[22]。进入小肠的碳水化合物在消化酶作用下，被降解为葡萄糖，而单糖需相应的转运载体转运才能被吸收。小肠上皮细胞中葡萄糖转运载体数量及活性能够随着肠腔中葡萄糖浓度的增加而提高[23]。在转运葡萄糖过程中SGLT1扮演着重要的角色，也是反映小肠对营养物质吸收能力的重要指标，且受肠腔中营养素的调控[24]。从本试验结果来看，MC组与LC组十二指肠、空肠SGLT1基因表达量极显著低于HC组，同时，MC组回肠的SGLT1基因表达量显著低于HC组。说明HC组所摄入的精料量相较于其他2组在瘤胃中降解速度更慢，且能更多地到达小肠，被其消化酶进一步消化产生的葡萄糖较多，继而促进了葡萄糖转运载体基因的高度表达，以提供更多葡萄糖转运载体用于对葡萄糖的消化吸收，这与HC组十二指肠、空肠及回肠SGLT1基因mRNA表达量均显著高于MC组和LC组相吻合，进一步证实了SGLT1基因能促进反刍动物对于葡萄糖的吸收。

GLUT1能够提供葡萄糖跨膜运输来生成ATP以及合成大分子，同时也转运其他如半乳糖、甘露糖和葡萄糖胺等物质[25]。适宜的精粗比日粮能够提高母羊对纤维素的分解能力，继而促进葡萄糖的生成[26]。在大鼠上研究发现，当细胞外葡萄糖浓度增加时，能够提高细胞膜上GLUT1的表达[27]。占今舜等[28]同样证实，精粗比为65∶35组犊牛的肝脏、瘤胃、十二指肠和盲肠GLUT1基因的mRNA相对表达量显著高于精粗比为60∶40组。本研究结果显示，HC组十二指肠与空肠GLUT1基因的表达量极显著高于MC组与LC组。另外发现各组间回肠GLUT1基因的表达量无显著影响，这与上述人员的研究结论具有相似之处。由此推测十二指肠与空肠可能是糖类消化吸收的主要场所，导致进入回肠内葡萄糖的浓度下降，进而造成回肠GLUT1基因的表达量在不同组间差异不显著。这进一步表明精粗比为70∶30的日粮更利于黑藏羊吸收葡萄糖以供应机体生长和发育的需要。在奶牛上研究发现[29]，与正常对照组（精粗比40∶60）相比，高精料组（精粗比60∶40）肝脏组织中GHR、JAK2、STAT5A和STAT5B基因的mRNA表达水平显著下调。叶平生[30]在奶山羊上的研究也揭示，在高精料日粮的饲喂条件下，肝脏组织中GHR、JAK2和STAT5基因的mRNA表达水平均出现下调，其中JAK2基因的mRNA表达水平显著下调。而在本试验中，通过对小肠中JAK2基因的mRNA表达水平进行检测，发现十二指肠、空肠JAK2基因的mRNA表达量随着日粮精料量的提高而增加，同时HC组回肠JAK2基因的mRNA表达量显著高于MC组，这与上述人员的研究结论不一致。这可能由于当日粮中精料占70%时，黑藏羊为了维持基本生命活动，上调JAK2基因的mRNA相对表达量，以增加回肠对小肽吸收所致。

综上，在本试验条件下，不同精粗比日粮能够显著影响黑藏羊小肠各段组织中PEPT1、SGLT1、GLUT1以及JAK2基因的mRNA表达丰度，可能会影响小肠对营养物质的转运吸收，其中以精粗比为70:30的日粮效果较佳。