兰索拉唑致皮肤炎症的机制研究

马梦圆，程紫萍，孙鲁宁，钱徐萍，孙诗钰，王 雨，陈安九*，王永庆，3*

1徐州医科大学江苏省新药研究与临床药学重点实验室，江苏 徐州 221004；2南京医科大学第一附属医院药学部，江苏 南京 210029；3南京医科大学药学院，江苏 南京 211166

质子泵抑制剂（proton pump inhibitor，PPI）是一类对各种原因所致的胃酸分泌增加都有良好效果的抑酸药，已成为临床抗酸治疗的一线用药［1-2］。随着PPI 临床广泛应用，其潜在的不良反应也逐渐显现［3］。长期使用PPI可诱发骨质疏松症、肝肾损害及潜在的心血管风险等［4-6］已被证实，且诱发皮肤不良反应（cutaneous adverse drug reaction，cADR）的报道也在逐渐增加［7］。PPI 引起的cADR 大多是免疫性的，包括即时和迟发性超敏反应，多数情况下表现为斑丘疹、红斑和瘙痒等，一般措施如停药和外科基础护理即可缓解。然而，如亚急性红斑狼疮、中毒性表皮裂解症等严重不良反应可危及患者生命安全，这些cADR常伴随炎症反应。研究表明，核因子（nouclear factor，NF）⁃κB 可调控细胞因子等在皮肤组织内的表达，参与皮肤炎症性相关疾病的发生［8］。角质形成细胞（HaCaT）是皮肤组成的主要部分，可抵御外源性损伤而保护机体。当皮肤受到刺激后，HaCaT会产生多种细胞因子，诱导炎症级联反应。兰索拉唑（lansoprazole，LPZ）是目前临床常用的二代PPI，与一代的奥美拉唑相比，抑酸作用强烈且持久，耐受性好。Kepil等［9］的研究表明兰索拉唑是诱发cADR 的“罪魁祸首”。因此，本研究首先通过体内实验，其次以HaCaT 中NF⁃κB 信号通路为基础，运用Western blot等技术，探究兰索拉唑诱发皮肤损伤的可能机制，为临床安全用药提供一定参考。

1 材料和方法

1.1 材料

兰索拉唑原料药（纯度：99.45%，武汉远成共创科技有限公司）；羧甲基纤维素钠（黏度：600～3 000 Pa.s，上海麦克林生化科技有限公司）；兰索拉唑标准品（纯度：99.6%，批号：100709⁃201705，中国食品药品检定研究院）；青链霉素混合液（双抗）、GAPDH抗体（货号：GB11002）、HRP 标记山羊抗兔IgG（货号：GB23303）等（武汉Servicebio 公司）；Cell Count⁃ing Kit⁃8（CCK⁃8试剂盒）、一抗稀释液、二抗稀释液、吡咯烷二硫代甲酸铵（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）（货号：S1808）、PMSF、RIPA 裂解液等（上海碧云天）；胎牛血清（Biological Industries 公司，以色列）；DMEM 培养基、Trypsin⁃EDTA 消化液（Gibco 公司，美国）；DMSO（Sigma公司，美国）；PVDF 膜（Mer⁃ck 公司，美国）；NF⁃κB p65（D14E12）抗体（货号：8242S）、Phospho⁃NF⁃κB p65（Ser 536）抗体（货号：3033S）、白介素（interleukin，IL）⁃6 抗体（货号：12153S）（Cell Signaling Technology 公司，美国）；IL⁃1β抗体（货号：AF4006）（Affinity 公司，美国）；化学发光液（Millipore公司，美国）；人永生化角质形成细胞HaCaT 细胞株（GDC0106）（武汉大学中国典型培养物保藏中心）；ICR 小鼠（SPF 级，合格证号：NO.201905643，（南京市青龙山动物养殖场），雌雄各半，18～22 g，于中国药科大学动物实验中心饲养，并获得伦理委员会批准（动物伦理编号：IACUC⁃1910006）。

化学发光图像分析系统Tanon 5200 Multi（上海天能科技有限公司）；电泳仪PowerPacTMBASIC（Bio⁃Rad 公司，美国）；酶标仪（Bio Tek 公司，美国）；超声破碎仪（Sonics公司，美国）；离心机（Eppendorf公司，德国）。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分组与给药

小鼠购入后适应性饲养3 d，之后随机分为3组：①对照组；②低剂量组：兰索拉唑250 mg/（kg·d）；③高剂量组：兰索拉唑1 000 mg/（kg·d）。1 周灌胃给药7 次，每日灌胃给药时间不定，对照组予0.5%CMC⁃Na 溶液灌胃，低剂量组予12.50 mg/mL 的兰索拉唑混悬液，而高剂量组予50.00 mg/mL 的兰索拉唑混悬液。每日称量记录小鼠体重，连续给药6 个月。对小鼠行脱颈椎处死后，在小鼠颈部涂抹脱毛膏，静置5 min，脱毛完全，剪下小片表皮放入多聚甲醛中进行固定，后期作石蜡包埋。将小鼠皮肤组织的蜡块交由武汉赛维尔公司制作HE染色和IL⁃6的免疫组化切片。

1.2.2 细胞培养及分组

HaCaT用含1%双抗、10%胎牛血清的DMEM培养基培养于37℃、5%CO2的培养箱中，隔日换液。按照1∶3传代，取对数期生长状态好的细胞开展实验。

第一阶段实验用0.1%DMSO、10、20、40 μmol/L兰索拉唑孵育细胞24 h或48 h。第二阶段实验分为DMSO 组（0.1%）、PDTC 组（20 μmol/L）、PDTC+LPZ组、LPZ 组（40 μmol/L）共4 组。各组间DMSO 含量一致，共同培养24 h或48 h。

1.2.3 CCK⁃8法检测不同浓度兰索拉唑作用于细胞24 h后细胞活力

设立空白培养基，培养基（含0.1%DMSO）孵育HaCaT为对照组，另予10、20、40、80、160、200 μmol/L的兰索拉唑孵育细胞24 h 后，CCK⁃8 试剂盒检测，37 ℃孵育2.5 h 后测定吸光值，通过与各对照组分析比较，评价不同浓度兰索拉唑对细胞活力的影响。

1.2.4 Western blot法检测蛋白表达

兰索拉唑孵育细胞后，加裂解液于冰上静置10 min 后刮下细胞。细胞破碎超声后，于4 ℃、14 000 r/min 离心15 min 后取上清。BCA 试剂盒测定蛋白样品的浓度，调齐浓度加入5×蛋白上样缓冲液，蛋白样品煮沸变性后-20 ℃保存。配胶后每个泳道均以35 μg 总上样量进行电泳，待蛋白分离后停止电泳。湿转法将蛋白转至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉溶液室温下封闭90 min。经1×TBST缓冲液漂洗后，4 ℃冰箱一抗孵育过夜。隔日用TBST漂洗条带10 min，重复3次。摇床上二抗室温孵育1.5 h，结束后仍用TBST 缓冲液漂洗，最后进行曝光。以GAPDH 为内参，用Image J 软件对Western blot 条带的灰度值进行半定量分析，各给药组目的蛋白的表达通过对照组进行标准化。

1.3 统计学方法

实验数据用均数±标准差（）表示，采用Graphpad Prism 8.0 软件进行画图、非线性拟合，多组间的比较使用单因素方差分析和Turkey’s检验或Dunnett T3检验，P＜0.05为差异有统计学意义。每项实验均独立重复3次。

2 结果

2.1 长期灌胃兰索拉唑后，小鼠皮肤组织出现炎症损伤

皮肤组织切片的HE染色结果如图1所示，与对照组相比，低剂量组、高剂量组的表皮发生不规则增厚，角质细胞坏死，并出现细胞水肿，炎症细胞外渗及叠痂等现象。高剂量组与低剂量组相比炎症表现更加显著，增生更严重。IL⁃6 免疫组化结果显示长期予兰索拉唑灌胃后，空白对照组IL⁃6几乎不表达，低剂量组呈低表达，而高剂量组则高表达IL⁃6，提示小鼠出现炎症损伤。

图1 小鼠皮肤组织切片的HE染色和IL⁃6免疫组化Figure 1 HE staining and IL⁃6 immunohistochemistry of mouse skin tissue sections

2.2 兰索拉唑可降低HaCaT细胞活力

选用10～200 μmol/L 兰索拉唑处理细胞24 h 或48 h后，统计吸光值并分析。结果如图2所示，随着兰索拉唑给药浓度的增加，细胞存活率逐渐下降。孵育过程中，显微镜下观察细胞状态，较高浓度培养后细胞生长减缓、形态皱缩、细胞活力降低。根据细胞存活率作折线图，由Hill 方程计算得兰索拉唑孵育24 h 后对应的半抑制浓度（IC50）为134.5 μmol/L，而48 h 对应的IC50为89.98 μmol/L，此时细胞生长抑制率为50%，这说明兰索拉唑可降低Ha⁃CaT 细胞的生长活力，且与24 h 相比，48 h 的IC50更低，因此孵育时间越长，兰索拉唑对细胞活力的降低程度越大。

图2 不同浓度兰索拉唑孵育HaCaT 24 h或48 h后细胞活力变化Figure 2 Changes in cell viability of HaCaT after 24 h or 48 h incubation with LPZ at different concentra⁃tions

2.3 兰索拉唑可活化NF⁃kB 通路促进HaCaT 炎症因子表达

选用10～40 μmol/L 的兰索拉唑处理细胞24 h、48 h后，同时予DMSO作对照，检测分析各组细胞中炎症因子的表达量。兰索拉唑孵育HaCaT 24 h 结果如图3所示，与对照组相比，蛋白p65的磷酸化水平随着兰索拉唑浓度的提高而逐渐增加，炎症因子IL⁃6、IL⁃1β的表达量也逐渐增加，且与对照组相比，40 μmol/L的兰索拉唑孵育HaCaT 24 h后IL⁃1β的表达量显著增加。图4示兰索拉唑孵育细胞48 h后，P⁃p65表达量逐渐增加，与对照组相比，不同浓度兰索拉唑增加P⁃p65 蛋白表达量具有显著性差异。同时，结果分析表明，40 μmol/L 组兰索拉唑可显著增加HaCaT 中IL⁃6、IL⁃1β蛋白的表达（图4C、D）。以上结果说明兰索拉唑可促进P⁃p65 蛋白的表达，介导NF⁃kB通路的活化，促进细胞炎症因子表达。

图3 不同浓度兰索拉唑孵育HaCaT 24 h后P⁃p65、IL⁃6、IL⁃1β含量变化Figure 3 Changes of P⁃p65，IL⁃6 and IL⁃1β in cells cultured with different concentrations of LPZ for 24 h

图4 不同浓度兰索拉唑孵育HaCaT 48 h后P⁃p65、IL⁃6、IL⁃1β含量变化Figure 4 Changes of P⁃p65，IL⁃6 and IL⁃1β in cells cultured with different concentrations of LPZ for 48 h

2.4 NF⁃κB通路抑制剂PDTC能缓解兰索拉唑诱发的细胞损伤

本研究使用PDTC（20 μmol/L）单独或联合兰索拉唑孵育细胞24 h 或48 h，检测蛋白表达水平的变化，进一步验证NF⁃κB信号通路活化在兰索拉唑诱导的皮肤炎症中发挥的作用。孵育细胞24 h 结果见图5A。如图5B 所示，与对照组相比，LPZ 组P⁃p65 蛋白的表达量显著增加，而PDTC 组与PDTC+LPZ 组未见显著增加。图5C、D 显示，与对照组相比，LPZ组的炎症因子IL⁃6和IL⁃1β的表达量显著增加，而PDTC 组未见显著增加。图5D 结果还表明，与LPZ组相比，PDTC+LPZ组炎症因子IL⁃1β的表达明显下降，而PDTC 组各蛋白表达水平与对照组相比，均无显著性增加，说明各蛋白表达量变化均与药物相关，不受其他因素影响。细胞孵育48 h结果如图6 示，与对照组相比，LPZ 组P⁃p65 蛋白的表达明显增加，炎症因子表达量也明显增加，表明通路活化。同时，PDTC+LPZ组与LPZ组相比，炎症因子IL⁃6、IL⁃1β的表达量明显降低，说明PDTC能够通过抑制兰索拉唑的作用，减少炎症因子的表达。以上结果表明，兰索拉唑诱发皮肤的炎症损伤可能与NF⁃κB 信号通路激活有关，抑制剂PDTC 能够阻断通路的激活，减少炎症因子的表达。

图5 PDTC单独或联合兰索拉唑孵育HaCaT 24 h对P⁃p65、IL⁃6、IL⁃1β表达的影响Figure 5 Effects of PDTC alone or combined with LPZ on the expression of P⁃p65，IL⁃6 and IL⁃1β in HaCaT for 24 h

图6 PDTC单独或联合兰索拉唑孵育HaCaT 48 h对P⁃p65、IL⁃6、IL⁃1β表达的影响Figure 6 Effects of PDTC alone or combined with LPZ on the expression of P⁃p65，IL⁃6 and IL⁃1β in HaCaT for 48 h

3 讨论

目前关于PPI在炎症方面作用的相关研究结论不一。Chen 等［10］认为联合使用PPI 可减缓炎症反应，降低胰腺炎发生率，延缓疾病发生发展。而Ye等［11］认为联合使用兰索拉唑能够加重顺铂诱导的炎症反应，继而加重急性肾损伤。还有研究表明，PPI 可能会引起肠道微生物群组成的改变，诱发肠道并发症［12］。目前有关于PPI对皮肤损伤的研究较少，兰索拉唑诱发的丘疹、斑疹、瘙痒等皮肤反应多伴随炎症的发生。NF⁃κB通路常用于炎症发生的机制研究，p65 的磷酸化水平是证实通路活化的检测指标，细胞受到刺激后，其抑制蛋白（IκB）⁃α发生磷酸化或被降解，并刺激p65 的磷酸化和入核。研究表明，NF⁃κB信号通路的活化可激发炎症因子IL⁃6、IL⁃1β的表达，进一步地，炎症因子的表达正反馈激活炎症通路［13］。现有的研究均从临床案例分析兰索拉唑诱导皮损的原因，很少从体内和体外实验层面探讨质子泵抑制诱发皮肤炎症的机制研究，因此本研究从动物实验和分子学层面探索兰索拉唑诱发皮肤炎症的可能机制。

首先，本研究通过灌胃给药建立了长期使用兰索拉唑的小鼠模型，建立模型之前，通过预实验发现灌胃给予兰索拉唑250 mg/（kg·d）后，峰值浓度约为4 000 ng/mL，几乎接近临床常规剂量治疗的血浆峰值浓度。然后，在此基础上设立了一个4 倍的浓度，此浓度的设立基于Ⅰ期临床的毒理学实验给药剂量的设置。结果表明，兰索拉唑长期灌胃给药后，小鼠皮肤组织出现炎症损伤，HE染色和IL⁃6的免疫组化实验结果也验证了这一现象。其次，本研究通过CCK⁃8细胞增殖实验检测兰索拉唑对HaCaT细胞活力的影响，预实验结果表明在10～200 μmol/L浓度范围内，随着兰索拉唑给药浓度的增加，细胞活性逐渐降低。结果显示，兰索拉唑孵育HaCaT 48 h 较24 h 的IC50值更低，说明兰索拉唑能够明显降低细胞活力，且与时间相关。其次，研究发现兰索拉唑在40 μmol/L 时能够活化NF⁃κB 通路，促进炎症因子的表达，从而导致炎症损伤。为了进一步验证兰索拉唑诱发的炎症损伤与NF⁃κB 信号通路相关，本研究将PDTC 单独或联合兰索拉唑孵育细胞后发现，与LPZ 组相比，PDTC+LPZ 组的P⁃p65表达量明显降低，且炎症因子表达也显著减少，这说明PDTC 能够抑制兰索拉唑诱导的NF⁃κB 通路的激活及减少炎症因子的表达。

综上所述，兰索拉唑诱导的皮肤炎症和炎症因子表达量的增加与NF⁃κB 通路的激活相关，而孵育PDTC 后可通过抑制兰索拉唑介导的NF⁃κB 通路的激活，降低炎症因子的表达，减轻兰索拉唑对HaCaT 的炎症损伤。多年来，随着PPI在定义不明确的适应证中的应用、长期使用出现的不良后果，以及随之增加的卫生保健费用引起了人们的关注［14］，PPI致cADR的报道也逐渐增多，如何避免CADR的发生及针对cADR更优效的药物，值得进一步研究，这也对促进PPI 的临床安全合理使用更加重要。