尿毒症心肌病发病机制的新进展

陈 铖，邢昌赢，毛慧娟

1南京医科大学第一附属医院肾内科，江苏 南京 210029；2扬州市职业大学医学院，江苏 扬州 225100

慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）是一个全球性的公共健康问题，CKD可导致心血管疾病风险增高，最终缩短患者寿命。在终末期肾脏病（end stage renal disease，ESRD）患者中，心血管疾病导致的病死率较普通人群高出15～30 倍。在诸多CKD心血管并发症中，尿毒症心肌病（uremic cardio⁃myopathy，UCM）日益受到人们关注。UCM 常表现为左心室肥厚（left ventricular hypertrophy，LVH）、心脏收缩和/或舒张功能障碍，并可出现心脏纤维化。超过70%的ESRD 患者会出现LVH［1］。上述心脏结构与功能异常可导致心脏机械活动和心脏电活动异常［2］。

LVH是UCM特征性的病理改变，约40%的估计肾小球滤过率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）＜30 mL/（min·1.73 m2）的患者心脏超声检查已出现LVH，而在ESRD 患者中有80%左右出现LVH。在CKD或ESRD患者中，LVH与患者死亡、伴有心脏收缩和舒张功能异常的心力衰竭、心律失常等密切相关。事实上，心脏结构改变在CKD早期就已开始，LVH 患病率增高与肾功能恶化呈线性相关。在CKD 患者中，心脏舒张功能异常很常见，有2/3的CKD 2～4期患者已出现心脏舒张功能异常，在ESRD 患者中这一比例则高达85%。舒张功能障碍与LVH、心脏纤维化高度相关，并可导致患者病死率上升。并且舒张功能障碍是透析患者频繁出现肺水肿、透析过程中低血压的主要原因之一［3］。左心室收缩功能异常在CKD 早期患者中发生率低于舒张功能异常，但在ESRD患者中，左心室收缩功能异常发生率明显升高，是正常人群的10～30 倍。心脏纤维化也是UCM 特征之一。在上世纪90 年代，对于CKD 或ESRD 死者尸检的研究中发现，有91%的心脏标本出现心脏纤维化，同时动脉却尚未见明显的管腔狭窄。纤维化的程度与透析时间有关，与血压、糖尿病、贫血等因素无关。数十年后，Aoki等［4］对40 例伴有左心室射血分数降低但无冠脉疾病的ESRD 患者进行心内膜下心肌活检，发现心脏存在广泛的纤维化。

1 尿毒症心肌病的危险因素与发病机制

UCM 的发病机制非常复杂，目前尚未全完阐明。学者们普遍认为导致UCM 的原因既有传统危险因素，也有与CKD特异性相关的非传统因素。

1.1 传统危险因素

血流动力学负荷异常［5-6］、肾素⁃血管紧张素⁃醛固酮系统激活［7］、交感神经系统激活［8］、转化生长因子⁃β（transforming growth factor⁃β）表达增加等。

1.2 非传统危险因素

1.2.1 继发性甲状旁腺功能亢进

CKD患者中持续升高的甲状旁腺激素（parathy⁃roid hormone，PTH）在血管钙化、心脏肥厚、心脏功能异常中发挥了重要作用［9-10］。高PTH血症可能是导致CKD（特别是ESRD）患者心血管原因死亡的重要因素。在ESRD 患者中的研究已证实，高甲PTH血症和心血管事件正相关。在心肌细胞中，PTH 与1型G蛋白偶联受体结合，激活腺苷酸环化酶，随后使得钙离子内流。钙离子内流可活化磷脂酶C⁃蛋白激酶C（phospholipase C⁃protein kinase C，PLC⁃PKC）信号通路，PKC 作用于其下游靶基因，促进心肌肥厚。肾脏是调节磷排泄、维持血磷平衡的重要器官，CKD 时血磷平衡受到影响，出现高磷血症。研究显示，在CKD患者中血磷升高和心血管死亡风险增加密切相关，一项超过14 000例透析患者的研究结果证实，血磷浓度和心血管疾病呈现正相关［11］。高血磷导致心血管疾病的机制非常复杂，高磷可能通过影响血管平滑肌细胞的Ⅲ型钠磷共转运体诱导血管钙化，导致血管顺应性降低，增加心脏后负荷，最终诱导心肌肥厚。大部分CKD 患者因25 羟维生素D 转化酶功能异常而出现维生素D 缺乏，多项流行病学及临床研究提示，在CKD患者中维生素D缺乏和心血管疾病密切相关，维生素D 除了影响肠道的钙磷吸收外，在心血管疾病中也发挥了重要作用。维生素D 在心脏中具有抗增殖作用［12］，其机制既与维生素D 对心肌细胞的直接作用有关，又与维生素D 调控肾素⁃血管紧张素⁃醛固酮系统、胰岛素系统有关。在体外培养的心肌细胞研究中发现，活性维生素D 可以抑制心肌细胞肥大。相反，维生素D受体敲除的小鼠可出现肾素mRNA和血浆血管紧张素Ⅱ水平的升高，并产生高血压和心脏肥厚，血管紧张素转化酶抑制剂则可减轻上述表现，补充维生素D也可降低肾素mRNA水平。在肾切除大鼠模型中，补充维生素D可降低成纤维细胞生长因子23（fibroblast growth factors，FGF23）的表达，并抑制其下游信号通路［13］。FGF23是一种由成骨细胞产生的可调节钙磷代谢的激素，通常情况下FGF23以具有生物学活性的全长分子形式存在，但也可被蛋白酶水解为氨基端和羧基端。FGF23可以和1型FGF受体以及其辅助因子Klotho 蛋白结合，减少肾小管对磷的重吸收，增加磷的排泄降低血磷。FGF23 还可通过抑制肾脏中α⁃羟化酶活性抑制1，25 羟维生素D 的活化。随着肾功能的下降，血清中FGF23 浓度进行性升高，ESRD 患者体内FGF23 浓度较正常人升高数千倍。临床研究已发现，血清FGF23水平和心血管疾病具有明显相关性，特别是和心脏肥厚密切相关，提示FGF23 可能是UCM 的致病因素。FGF23 干预体外培养的乳大鼠心肌细胞后发现，其具有诱导心肌细胞肥大，促进各种促心肌细胞肥大基因的表达的作用，其机制与FGF受体介导的磷脂酶γ⁃钙调磷酸酶⁃活化T细胞核因子（PLCγ⁃calcineu⁃rin⁃nuclear target of activated T cells）通路有关。向小鼠注射FGF23可以诱导促心脏肥厚基因表达，并且小鼠心室肥厚不依赖于血压和心脏收缩力的改变。在5/6 肾切除大鼠肾衰模型中，血清FGF23 水平明显升高，给予FGF 受体抑制剂可减少左室质量、室壁厚度和心肌细胞体积的增加［14］。但也有研究发现，FGF23与尿毒症心肌病无明确关系。2018年的一项研究报道，在无肾脏损害的前提下，循环中高FGF23 水平并不足以引起心血管疾病［15］，并且，不含钙的磷结合剂可以降低血清FGF23水平，但并不能改善CKD 患者左心室肥厚或心功能。显而易见，FGF23 对心脏结构和功能影响的机制目前尚不完全清楚，除了FGF23 对心脏的直接作用外，CKD相关的高FGF23 血症可能通过多个协同机制共同损害心脏。PTH、血磷、维生素D、FGF23 水平异常是慢性肾脏病⁃矿物质与骨代谢紊乱（chronic kidney disease⁃mineral and bone disorder，CKD⁃MBD）重要的表现之一。鉴于上述分子与UCM之间的密切联系，Paulo 等［16］提出，CKD⁃MBD 概念的范围应该加以扩大，尿毒症心肌病应包含在CKD⁃MBD范围中。

1.2.2 胰岛素抵抗

CKD患者常出现能量代谢异常，随着肾功能的下降，胰岛素抵抗愈发严重，当疾病进展为ESRD时，胰岛素的清除严重受损，这会进一步加重高胰岛素血症。临床研究证实胰岛素抵抗和CKD 患者心血管并发症密切相关，是ESRD 患者心血管死亡的独立预测因子。

1.2.3 内源性强心激素水平升高

已有研究发现通过部分肾切除术构建实验性CKD动物体内循环中的海蟾蜍毒素水平升高，而拮抗海蟾蜍毒素可缓解实验性UCM 的发展。通过微泵向大鼠体内输注海蟾蜍毒素，并使其浓度达到与部分肾切除导致CKD时相似的海蟾蜍毒素水平后，实验动物会出现与部分肾切除CKD 模型相似的UCM 表型。在部分肾切除或海蟾蜍毒素输注的大鼠模型中，氧化应激、促心脏肥厚基因表达是增加的。来源于心脏组织的海蟾蜍毒素具有促纤维化的作用，非特异性的酪氨酸激酶抑制剂除莠霉素（herbimycin）或非特异性的抗氧剂N⁃乙酰半胱氨酸则可以阻断这种作用，提示了内源性强心激素通过促纤维化参与UCM 发展。通过中和抗体拮抗内源性强心激素，或使用螺内酯和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）通路抑制剂雷帕霉素阻断其与Na+⁃K+⁃ATP酶结合，都可以抑制部分肾切除诱导CKD 心脏肥厚和纤维化［17］。内源性强心激素可以在不影响Na+⁃K+⁃ATP 酶泵活性的前提下激活Na+⁃K+⁃ATP 酶介导的级联信号通路，改变靶基因表达，这表明Na+⁃K+⁃ATP 酶具有受体样作用。Na+⁃K+⁃ATP酶受体功能的实现也需要原癌分子酪氨酸激酶Src通路介导的表皮生长因子反式激活后的蛋白募集和组装。当哇巴因与Na+⁃K+⁃ATP酶结合后，原癌分子酪氨酸激酶Src就离开其与Na+⁃K+⁃ATP 酶α1 亚基的结合位点并被活化。活化的原癌分子酪氨酸激酶Src可反式激活下游大量的效应器如细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulat⁃ed protein kinases，ERK）、mTOR 以及丝裂原活化蛋白 激酶（mitogen⁃activated protein kinase，MAPK）等。通过对哇巴因敏感或抵抗的Na+⁃K+⁃ATP 酶亚基转基因鼠进行胸主动脉缩窄手术增加心室负荷的研究发现，对哇巴因敏感的转基因鼠表现出更为严重的心功能障碍。此外，敲除Na+⁃K+⁃ATP酶α1亚基的小鼠行部分肾切除诱导CKD手术后可以发现，心脏中死亡的细胞明显增加，这些研究结果也进一步验证了内源性强心激素介导的Na+⁃K+⁃ATP 酶信号通路在UCM有着重要的作用。

1.2.4 Na+⁃K+⁃ATP 酶⁃原癌分子酪氨酸激酶Src⁃活性氧放大环

在早期的研究中已发现，Na+⁃K+⁃ATP 酶介导的信号转导和活性氧（reactive oxygen species，ROS）生成之间存在内在联系，并且在哇巴因诱导心肌细胞肥大的体外研究中发现，ROS 在此过程中起到了十分重要的作用，抗氧化剂N⁃乙酰半胱氨酸或维生素E都可以减轻心肌细胞肥大。ROS可以调控Na+⁃K+⁃ATP酶α1亚基的结构和功能，其可通过诱导α1亚基的羰基化激活Na+⁃K+⁃ATP酶信号通路，继而激活原癌分子酪氨酸激酶Src 及其下游的ERK 信号通路，最终促进ROS 生成。因此ROS 不仅是由Na+⁃K+⁃ATP酶产生，也可以反过来激活Na+⁃K+⁃ATP酶，形成一个正反馈的Na+⁃K+⁃ATP 酶放大环［18］。使用可以拮抗Na+⁃K+⁃ATP酶⁃原癌分子酪氨酸激酶Src信号通路的Na+⁃K+⁃ATP 肽可以减轻UCM［18］。在肾大部切除诱导UCM小鼠中，Na+⁃K+⁃ATP肽干预可以减轻系统性的氧化应激和Na+⁃K+⁃ATP酶放大环，改善心脏肥厚与纤维化，改善左心室舒张功能，甚至可以减轻贫血［18］。

1.2.5 T细胞也参与了UCM的发展

Pamela 等［19］发现CKD小鼠心脏内T细胞浸润，其中包括带有记忆分化标记CD44hi的T细胞以及带有激活标记PD⁃1、KLRG1、OX40的T细胞。耗竭T细胞可以改善CKD小鼠心脏的舒张功能和心肌劳损。

1.2.6 microRNA

国内学者发现，microRNA（miR）亦参与了UCM。Wang 等［20］研究发现，miR⁃155 可加重UCM，其机制与抑制FoXO3a表达，促进心肌细胞焦亡（py⁃roptosis）有关。有趣的是，miR⁃26a 却可以减轻UCM。Wang 等［21］的另外一个研究发现，CKD 小鼠心脏中miR⁃26a 表达降低，向CKD 小鼠注射miR⁃26a 可减轻心脏纤维化，改善心功能。以上结果提示，miR 参与UCM，且不同miR 对UCM 产生不同的影响。

1.2.7 尿毒症毒素

越来越多的证据表明，尿毒症状态是UCM发生发展的重要原因［22］，正常人体需要经过肾脏代谢或排出大量化合物，但肾功能异常时，这些化合物会在机体内大量蓄积［22-24］，这些在体内异常蓄积的化合物被称为尿毒症毒素。有些毒素，如硫酸对甲酚（p⁃cresyl sulfate，PCS）是CKD 患者全因死亡和心血管死亡的独立预测因子［25］。

一般情况下，一个人每日肠道摄入的蛋白或多肽大部分来自于外源性的食物。蛋白或多肽被分解为小的寡肽或者氨基酸。这些寡肽、氨基酸可以被结肠内的菌群吸收利用，或在酶作用下进一步代谢。酪氨酸、苯丙氨酸等芳香族氨基酸主要在结肠远端经过一系列脱氨基、转氨基、脱羧基等化学反应转换成苯酚或甲酚等酚类化合物［26］。在结肠黏膜、肝脏中甲苯酚被硫化为PCS，进入循环系统，并与血浆蛋白可逆性结合。游离型的PCS经过肾小球滤过排出，结合型的PCS 由肾小管上皮细胞分泌排出。CKD 时PCS 排泄受到损害，导致体内PCS 浓度增高。

PCS 对心血管系统具有明显的毒性作用。首先，PCS可以损伤血管内皮细胞，伴有颈动脉粥样斑块的透析患者体内PCS浓度高于无颈动脉粥样斑块的患者，并且在为期5年的随访中发现，PCS浓度与颈动脉斑块面积增加正相关。多因素Logistic 回归分析提示PCS是颈动脉粥样硬化性斑块发生和进展的独立危险因素。在体外细胞实验中发现PCS处理内皮细胞后肿瘤坏死因子⁃α（tumor necrosis factor⁃α，TNF⁃α）、单核细胞趋化蛋白⁃1（monocyte chemo⁃tactic protein⁃1，MCP⁃1）水平明显增加。内皮细胞中细胞间黏附因子（intercellular adhesion molecule，ICAM）、血管间黏附分子（vascular cell adhesion mol⁃ecule，VCAM）水平也明显增加。在体内研究中发现，对行CKD造模的载脂蛋白E基因敲除（apo E⁃/⁃）组小鼠再予PCS 后，小鼠动脉的粥样斑块的面积较假手术组明显增加，斑块内胶原含量减少，这就提示了在体内PCS可促进动脉粥样硬化的发生［27］。Li等［28］对载脂蛋白E 基因敲除（apo E⁃/⁃）组小鼠PCS灌胃，发现PCS 可以诱导动脉粥样硬化斑块的生长和不稳定。Gross 等［29］研究发现，PCS可以诱导内皮细胞氧化应激，加重苯肾上腺素诱导小鼠主动脉血管的收缩，其机制和PCS激活Rho激酶有关。有研究选取了100 例透析患者，检测了血清中PCS 前体甲苯酚的浓度，发现血清甲苯酚的浓度与循环中内皮微粒的数量正相关。此外，他们还在体外实验中发现，予PCS处理人脐静脉内皮细胞，PCS以浓度依赖性的方式，促进内皮微粒的释放。在血液透析患者中，颈动脉脉搏波速度与血清PCS 浓度具有相关性。其次，PCS可诱导血管平滑肌钙化。研究发现，予腺嘌呤喂食大鼠构建CKD大鼠模型，并予PCS灌胃，可诱导大鼠主动脉和外周动脉钙化，为了明确PCS 诱导血管钙化的机制，研究者应用蛋白组学结合生信分析的方法发现PCS 激活急性时相反应信号通路以及凝血、糖代谢信号通路。此外PCS 还可促进miRNA29b、miRNA223 表达，继而激活wnt7b/β⁃catenin 通路，诱导平滑肌细胞向成骨细胞转分化［30-31］。除此之外，PCS对心脏也有毒性作用。Han等［32］研究发现，通过5/6 肾切除手术建立CKD 小鼠模型，并予PCS 灌胃。相比对照组或未摄入PCS 的CKD组，CKD+PCS组小鼠的心脏超声显示E峰/A峰下降，这提示了PCS处理的CKD小组心脏舒张功能出现明显减退。小鼠心脏组织Tunel 检测提示CKD+PCS组小鼠心肌细胞凋亡明显增加，其机制与PCS 促进NADPH 氧化酶亚基和细胞内ROS 表达有关。

本课题组最新研究发现，PCS 可以诱导心肌细胞肥大，其机制和PCS下调去乙酰化酶SIRT6表达，继而诱导mTOR 信号通路活化有关。此外还发现PCS 可以诱导心肌细胞凋亡，其机制与PCS 诱导心肌细胞DNA双链断裂有关。动物实验发现，PCS可以加重5/6 肾切除诱导的小鼠UCM，主要表现为加重心脏肥大、纤维化，增加心脏细胞凋亡。

除了PCS，另一种尿毒症毒素硫酸吲哚酚（in⁃doxyl sulfate，IS）在UCM 中也起到了重要作用。国内学者Yang 等［33］发现，IS 通过活化NADPH 氧化酶2/4、MAPK 信号通路等途径诱导心肌细胞肥大。Hsu 等［35］发现，IS诱导心肌细胞线粒体产生活性氧，损伤心肌细胞，其机制与IS促进心肌细胞中1型大麻素受体（cannabinoid receptor type 1）和转录激活因子3（activating transcription factor，ATF3）表达，增加c⁃Jun 通路磷酸化水平有关［34］。在盐敏感高血压大鼠中，输注外源性IS可导致心脏纤维化。临床研究也发现，循环中IS水平增高与左心室舒张功能异常有关［36］。此外，IS 还可影响心脏的电活动，IS 与QT 间期延长独立相关，而QT 间期延长可导致室性心律失常［37］，其机制可能与增加氧化应激［38］、延迟整流钾电流通道导致复极推迟有关［38］。有趣的是，除了上述蛋白质代谢产物类的毒素，有学者提出，尿毒症时机体内过高的FGF23、PTH 等也应视为尿毒症毒素［39-40］。

1.2.8 Klotho缺乏

Kuro⁃o等［41］在研究原发性高血压病实验中发现了具有抗衰老作用的Klotho基因及其编码的Klotho蛋白，其主要在肾脏、甲状旁腺以及脉络膜中表达。在人类和小鼠中，Klotho 基因由5 个外显子构成，Klotho蛋白存在1个较长的胞外域和1个较短的C 基端的胞内域。胞外域由两个氨基酸重复序列Kl 1和Kl 2组成［42］。Klotho 蛋白有膜型与可溶性两种形式。膜型Klotho蛋白与FGF23受体结合充当辅助受体介导FGF23信号的转导。Klotho亦以可溶性蛋白的形式存在于血液、尿液、脑脊液中。可溶性Klotho（soluble Klotho）包括由选择性转录剪切合成分泌性Klotho（secreted Klotho）以及裂解性Klotho（cleaved Klotho）组成。

研究已证实，CKD 时Klotho 表达减少［43］，Klotho缺陷小鼠会自发性产生早衰、血管钙化、LVH 以及心脏纤维化［44］。通过5/6肾切除法诱导野生型CKD的小鼠会出现Klotho表达表达下降，心脏肥厚、纤维化。Klotho 基因敲除杂合子（Kl/+）CKD 小鼠的心脏肥厚、纤维化更为严重［45］。膜型Klotho 蛋白并不在心脏直接表达，所以Klotho 蛋白对心脏的保护作用可能是由可溶性Klotho 实现。在体外实验中，Klotho可以拮抗TGF⁃β 以及血管紧张素Ⅱ诱导大鼠心肌细胞肥大［46］。在体内实验中发现Klotho可以抑制IS 诱导的小鼠心肌肥厚，其机制和Klotho 阻断ROS生成，抑制MAPK信号通路有关［47］。迄今为止，Klotho 对心脏保护的机制目前尚未完全阐明，但可能与以下机制有关：①过表达Klotho 可以减少系统性氧化应激、延长小鼠寿命，所以Klotho可能通过增强机体抗氧化应激能力保护心脏。②Klotho通过抑制瞬时受体电位钙离子通道亚基6（transient recep⁃tor potential Ca2+canonical isoform 6，TRPC6）保护心肌细胞，心脏特异性过表达TRPC6的小鼠会出现自发性心脏肥厚和纤维化，而Klotho 则可通过抑制TRPC6 表达和其离子通道的功能实现保护心脏的作用［48］。

本课题组最新研究发现，Klotho 可以抑制PCS诱导的心肌细胞肥大和凋亡，其机制和Klotho 抑制PCS下调SIRT6，继而抑制mTOR信号通路活化和抑制DNA双链断裂有关。有趣的是，我们的研究发现PCS在蛋白水平下调SIRT6表达，但不影响SIRT6基因表达，而Klotho 抑制PCS 下调SIRT6 的作用也发生在蛋白水平，Klotho 对SIRT6 基因表达也没有影响。这就提示了PCS/Klotho 对SIRT6表达的调控发生在蛋白质翻译或翻译后修饰的环节。检测SIRT6泛素化修饰水平，发现PCS可以促进SIRT6泛素化，而Klotho 抑制PCS 诱导的泛素化。研究结果显示，Klotho 对SIRT6 的泛素化调控可能参与了UCM，干预其调控有望成为UCM防治的分子靶标。

2 结论

UCM 的病理生理机制包括了多种相互作用的机制，尚未得到完全阐明。在UCM 发病机制中，既有传统的心血管危险因素，又有各种CKD特有的非传统因素，并且越来越多的证据提示，如尿毒症毒素蓄积、Klotho 缺乏等CKD 相关的非传统因素可能在UCM 的发生发展过程中起到更为重要的作用。随着生物医学科技的进步和对于UCM 发病机制研究的逐渐深入，UCM 发病机制将被不断揭示，并为UCM患者带来新的治疗策略。