HD11来源NDV Ex对鸡骨髓源树突状细胞活化和细胞因子水平的影响

丁 伟,刘婷婷,邹映雪,黄天鸿,冯嘉轩,曲书靓,苏佳鑫,张 頔,徐小洪,丁 壮 （吉林大学 动物医学学院 人兽共患病研究教育部重点实验室,吉林 长春 130062）

所有细胞均可以释放外泌体,其大小处于40～100 nm之间[1]。外泌体膜富含脂筏,通过与细胞膜相融合的方式释放。研究表明,外泌体中除蛋白质外,还包含DNA、m RNA、微小RNA等各种核酸[2]。有报道称,病毒可以借助外泌体将致病性蛋白或基因组运输至机体各处,促进病毒在机体内的扩散,导致免疫功能失调[3]。反转录病毒可以借助外泌体释放,进而感染周围细胞[4]。感染禽白血病病毒的细胞释放的外泌体可以激活CD4＋、CD8＋T细胞[5]。病毒感染细胞后会对宿主细胞释放的外泌体的组分产生影响,一方面机体可以利用外泌体发挥抗病毒免疫作用,而另一方面病毒也可以利用外泌体促进其在机体中的繁殖。因此,研究外泌体在病毒传播过程中发挥的作用是揭示机体抗病毒反应的重要方向之一。

新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）是一种重要的禽类病毒,强毒株在禽类种群内的传播给世界养禽业带来了巨大的经济损失。已有研究表明,NDV感染后细胞分泌的外泌体含有3种miRNA,具有促进NDV复制的作用[6]。另外,NDV感染细胞后分泌的外泌体中含有病毒蛋白NP、F、V和W,可以抑制抗病毒细胞因子的分泌,促进病毒增殖[7-8]。

然而,抗病毒天然免疫过程并非是单一种类细胞的活动,而是由多种细胞组织协作完成的,其中树突状细胞（dendritic cells,DCs）作为一种专职的抗原递呈细胞,是连接天然免疫反应和获得性免疫反应的重要桥梁[9]。未成熟DCs有较强的抗原递呈功能,经过病原相关分子模式（pathogen associated molecular pattern,PAMP）激活后,DCs便会从非淋巴组织迁移到次级淋巴组织的T细胞区,在此过程中DCs逐渐成熟,表面高表达MHCⅡ类分子和共刺激分子（CD40、CD86等）,抗原递呈及刺激T淋巴细胞活化能力显著增强,响应微生物感染进而启动机体免疫应答[10]。禽类DCs最早见于盲肠扁桃体,是位于肠黏膜的次生淋巴器官[11],随后在禽的其他淋巴组织及表皮发现了3种主要类型的树突状细胞,即并指状树突状细胞、滤泡树突状细胞和表皮树突状细胞,能够识别不同的微生物并直接启动相关信号途径[12]。禽类DCs体外培养仅有零星报道,极大限制了对禽类DCs的进一步研究与应用。近年来,随着新的chDCs标记的发现,为chDCs相关研究和应用提供了可能性[13-14]。

本试验利用重组鸡粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（chGM-CSF）和重组鸡白细胞介素4（chIL-4）体外诱导鸡骨髓细胞分化为鸡骨髓源树突状细胞（chicken bone marrow-derived dendritic cells,chBMDCs）,并对诱导条件进行优化,利用HD11来源NDV Ex刺激未成熟chBMDCs,通过形态学观察及表型鉴定来初步鉴定体外诱导培养所得的chBMDCs,检测chBMDCs活化情况及细胞因子水平,评估其对chBMDCs的影响。

1 材料与方法

1.1细胞、病毒、动物及主要试剂鸡巨噬细胞系HD11由本实验室保存；NDV强毒NA-1株（Gen-Bank:DQ659677）由本实验室分离保存；1～6周龄SPF鸡均购自哈尔滨兽医研究所；所有动物实验均按照吉林大学动物福利研究伦理委员会批准的实验操作规范操作（批准文号:2017060815-2）；protein A/G磁珠购自MCE公司；重组鸡GM-CSF蛋白、鼠TSG101抗体、PE标记的鼠抗鸡MHCⅡ抗体购自Abcam公司；重组鸡IL-4蛋白购自Kingfisher Biotech公司；Histopaque-1119购自Sigma公司；兔抗鸡CD40抗体购自博奥森公司；FITC标记的羊抗鼠抗体Multiscience公司；HRP标记的羊抗鼠抗体购自BiOworld公司；Eastep Super Total RNA Extraction Kit购自Promega公司；ECL发光液购自碧云天试剂公司。

1.2外泌体分离与鉴定

1.2.1外泌体的分离 HD11密度达95%时将培养基替换为不含FBS的DMEM,加入PBS或NA-1（MOI＝0.5）,以此来避免血清中外泌体残留。48 h后收集细胞上清液,经0.22μm滤器过滤,4℃、100 000×g（Beckman Coulter 480 Instruments）离心60 min。将超离产物用PBS洗涤1次后重悬于PBS中,通过BCA蛋白质测定试剂盒检测其浓度后储存于—80℃备用。将超离产物与鸡CD63抗体在室温下静置孵育30 min,将混合物与protein A/G磁珠在旋转条件下温育30 min。用PBS洗涤磁珠3次后用洗脱缓冲液（150 mol/L甘氨酸,p H2.7）洗脱,中和缓冲液中和后储存于—80℃备用。

1.2.2透射电子显微镜及Western blot鉴定外泌体 取20μL样品滴于200目铜网,5 min后用滤纸吸干液体,以2%多聚甲醛固定后经1%磷乌酸负染2 min,PBS清洗2次后经电镜观察外泌体形态。取样品上样SDS-PAGE凝胶进行电泳分离,将SDSPAGE凝胶经半干转至PVDF膜上,用5%脱脂奶粉封闭1 h。一抗为鼠TSG 101（1∶2 500）,二抗为1∶5 000稀释的HRP标记的山羊抗小鼠IgG。

1.3chBMDCs的分离及培养处死4周龄雏鸡,浸入75%乙醇中浸泡30 min,无菌条件下取出鸡股骨和胫骨,泡入预冷1640培养基中,注射器吸取含100 U/m L青霉素和100 mg/L链霉素的预冷1640培养基,冲洗骨髓至髓腔变白；收集冲洗液,过200目筛网,过滤组织块和骨碎屑,2 000×g离心10 min；弃上清液,收集沉淀并用淋巴细胞分离液重悬沉淀细胞,然后按照3∶1的比例向骨髓细胞悬液缓缓加入含1%双抗的预冷1640培养基,2 000×g离心10 min；收集中间交接面处的白色雾状细胞2 m L,重悬后2 000×g离心10 min,洗涤2次,弃上清液,收集沉淀。用含有10%胎牛血清（FBS）（Gibco,USA）、100 U/m L青霉素和100 mg/L链霉素的完全1640培养基重悬细胞,细胞计数。每只鸡可以分离到（2～5）×107个骨髓细胞。将分离所得骨髓细胞加入六孔细胞培养板中,每孔补加含有ch GM-CSF和chIL-4的完全1640培养基,终体积为2 m L,细胞终浓度2×106/m L,置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。每2 d用新鲜含细胞因子的完全1640培养基替换1/2的培养基,同时在第3,5天去除非黏附细胞（如粒细胞和死细胞）。第6天加入NA-1、NDV相关外泌体刺激细胞24 h,第7天收集细胞进行后续试验。

1.4chBMDCs形态学观察通过显微镜观察细胞形态、细胞聚集和细胞生长情况,并拍照记录不同培养条件对细胞分化的影响。

1.5chBMDCs纯度及表型检测将各组收集到的chBMDCs分别装入玻璃离心管中,1 000×g离心10 min后弃上清液,然后用0.01 mol/L PBS重悬细胞,调整细胞浓度至5×105/m L。向用于鉴定DC纯度的细胞（未刺激的DC）中加入PE标记的抗鸡MHCⅡ（abcam公司）,室温避光孵育20 min,0.01 mol/L PBS洗涤2次（1 000×g离心5 min）,然后用200μL PBS（0.01 mol/L）重悬DC,最后应用流式细胞仪进行检测；向用于鉴定DC成熟表型的细胞中加入无荧光标记的兔抗鸡CD40,室温孵育20 min,0.01 mol/L PBS洗涤2次（1 000×g离心5 min）,然后再加入FITC标记的羊抗鼠IgG（H＋L）（Multiscience公司）,室温避光孵育20 min后用0.01 mol/L/PBS洗涤2次（1 000×g离心5 min）,然后用200μL PBS（0.01 mol/L）重悬DC,最后应用流式细胞仪进行检测。

1.6chBMDCs活化相关分子mRNA检测通过Eastep Super Total RNA Extraction Kit（Promega,USA）提取对照组chDCs、NA-1、NDV相关外泌体刺激组ch DCs的RNA,随后使用M-MLV逆转录酶（Promega,USA）、oligo-d T和随机引物的混合物（1∶1）对所得RNA进行反转录。cDNA经无菌蒸馏水稀释作为qPCR的模板或在—40℃保存备用。qPCR采用Fast Start Universal YBR Green Master（瑞士罗氏公司）进行试验,并使用GAPDH的表达水平进行数据标准化,以基因的相对表达量2—△△Ct计算表达水平。表1中列出了本研究中用于qPCR的所有引物。

表1 引物信息表

2 结果

2.1外泌体的分离与鉴定使用鸡CD63抗体联合protein A/G磁珠处理超速离心产物,即外泌体和NDV病毒粒子的混合物。利用protein A/G磁珠联合鸡CD63抗体的分离方法分离得到外泌体后,经Western blot检测外泌体标志蛋白TSG 101（图1A）。透射电镜下可观察到外泌体形态,直径约为100 nm,具有典型的杯状结构,且无病毒粒子（图1B）,说明该方法可有效分离外泌体与NDV病毒粒子并且保持外泌体完整结构。

图1 外泌体的分离与鉴定

2.2chBMDCs培养条件优化

2.2.1不同淋巴细胞分离液对ch BMDCs分离效率的影响 分别使用Histopaque®-1119分离液和鸡外周血淋巴细胞分离液分离4周龄SPF鸡的骨髓细胞,添加自制鸡细胞因子GM-CSF和IL-4诱导培养6 d后观察细胞状态。结果显示,同禽外周血淋巴细胞分离液组相比,Histopaque®-1119分离液组chBMDCs的目的细胞数量更多,说明Histopaque®-1119分离液对鸡骨髓单核细胞的分离效率更高（图2）。

图2 不同淋巴细胞分离液对ch BMDCs分离效率的影响

2.2.2鸡日龄对chBMDCs分离效率的影响 在不同研究中,ch BMDCs分离所用鸡由1周龄到3月龄不等,因此,为了确认分离chBMDCs所用鸡的最佳日龄,我们使用Histopaque®-1119分离液分离1,3,4,6,8周龄SPF鸡的骨髓细胞,添加自制鸡细胞因子GM-CSF和IL-4诱导培养6 d后观察细胞状态。结果显示,相比于其他周龄SPF鸡,4周龄鸡骨髓分离所得的chBMDCs的数量和纯度都更好,同时在分离过程中我们发现同4周龄SPF鸡相比,6周龄SPF鸡骨髓脂肪化较严重（图3）。

图3 不同周龄SPF鸡chBMDCs的分离效果

2.2.3鸡品种对chBMDCs分离效率的影响 不同研究所选用鸡品种有很大差异,而所得的细胞形态也有极大差异,因此我们比较了4周龄SPF鸡（白来航）和一种常用肉鸡（岭南黄鸡）分离所得的chBMDCs的形态。结果显示,肉鸡分离所得chBMDCs较SPF鸡含有大量圆形杂细胞,表明SPF鸡（白来航）更适用于分离chBMDCs（图4）。

图4 不同鸡品种对ch BMDCs分离效果的影响

2.2.4细胞因子对chBMDCs分离效率的影响 在之前的研究中,我们通过Bac-to-Bac表达系统获得了真核表达的ch GM-CSF和chIL-4蛋白,但是其纯度一直未能达到理想水平,在培养chBMDCs过程中可能会活化chBMDCs由此影响试验结果。因此,在本试验中,我们比较了相同浓度下,商品化GM-CSF、IL-4与自制ch GM-CSF、chIL-4的chBMDCs诱导效果,结果表明虽然自制细胞因子可以有效刺激ch BMDCs分化,但是所得细胞多呈现成熟DC形态,说明自制细胞因子中的杂质可能会提前诱导DC的成熟,因此我们计划采用商品化ch GMCSF和chIL-4进行后续试验（图5）。

图5 不同细胞因子对chBMDCs分离效果的影响

2.2.5血清对chBMDCs分离效率的影响 我们比较了不同品牌胎牛血清（BI和Gibico）对chBMDCs分化的影响,为了排除血清中补体对对chBMDCs的影响,我们首先对血清进行了灭活处理。结果显示,使用灭活Gibico胎牛血清培养所得chBMDCs的纯度和比例都更高,培养6 d后chBMDCs比例可达70%左右（图6）,因此,我们确定使用Gibico胎牛血清进行后续试验。

图6 不同品牌血清对chBMDCs分离效果的影响

2.3NDV Ex对天然免疫细胞活化的影响为了检测NDV Ex对ch BMDCs活化的影响,我们以PBS、NDV Ex、NDV（MOI＝0.5）处理chBMDCs,24 h后观察细胞形态,分别以流式细胞术检测MHCⅡ、CD40的表达情况,以qPCR检测MHCⅡ、CD40、CD80、CD86、CD11b、CCR6、CCR7的转录水平。结果显示,NDV和NDV Ex处理后chBMDCs的形态会发生显著变化,细胞会显著聚团、形态呈现拉丝和多形性（图7）；流式细胞术检测显示NDV Ex处理会显著抑制MHCⅡ的表达,轻微抑制CD40的表达（图8）；与其一致的是,NDV Ex处理会显著抑制MHCⅡ、CD83、CD40等DC活化相关的细胞因子的转录（图9）。结果表明,NDV Ex会抑制chBMDCs的活化。

图7 不同刺激物处理后chBMDCs的形态变化

图8 不同刺激物对chBMDCs MHCⅡ、CD40表达量的影响

图9 不同刺激物对chBMDCs各细胞因子mRNA的影响

3 讨论

自从1991年利用GM-CSF体外诱导培养DCs以来,DCs研究已经取得极大进展,尤其是人类和小鼠的DCs体外培养极大促进了DCs功能和临床应用的研究[15-16]。在已经建立的骨髓细胞诱导培养DCs的方法中,骨髓细胞多来源于鼠等实验动物[17]。经典DCs培养的细胞因子组合是GM-CSF和IL-4[18]。GM-CSF可促进骨髓细胞发育,是生成和维持DCs发育和分化的最根本的细胞因子,IL-4抑制粒细胞和巨噬细胞产生,促进单核细胞向DCs的转化,并维持DCs成熟[19-20]。但是目前为止尚没有相对成熟、效率较高的ch DCs诱导培养方法,导致ch DCs及其免疫学相关研究相对滞后。因此,建立一种高效成熟chBMDCs体外诱导培养方法尤为重要。本试验通过Bac-to-Bac表达系统获得了真核表达的chGM-CSF和chIL-4,但是其纯度一直未能达到理想水平,因此我们采用商品化chGM-CSF和chIL-4进行下一步试验。本研究最终有效优化了chBMDCs的分离培养条件,即使用Histopaque®-1119分离液,4周龄SPF（白来航）鸡,经灭活处理的Gibico血清,商品化的chIL-4和ch GM-CSF培养6 d得到未成熟chBMDCs。

DC接触抗原刺激后会经历复杂的成熟活化过程,表现为上调细胞表面主要组织相容性复合体MHCⅠ和MHCⅡ以及共刺激分子CD80、CD86和CD40[21]。正常情况下,不成熟的DC捕获抗原并逐渐成熟,然后迁移到淋巴结激活T细胞,启动适应性免疫反应[22]。然而,微环境中的特异性信号也可能会抑制DC成熟,导致形成具有免疫抑制或免疫耐受的树突状细胞[23-24]。在本试验中,我们发现NDV Ex会抑制chBMDCs的活化。研究表明,外泌体可通过模式识别受体调节DC的功能,例如胰腺癌细胞来源外泌体中的miR-203可以下调树突状细胞TLR-4表达,并减少TLR-4下游细胞因子如TNF-α和IL-12的表达[25]。此外,IL-6、IL-10可以通过活化DC内STAT3信号传导通路抑制LPS诱导的DC成熟[26-28]。因此,在后续试验中,我们将检测IL-6、IL-10以及模式识别受体在NDV Ex引起的DC活化抑制过程中的作用。

外泌体及其组分在介导天然免疫细胞的抗病毒作用中发挥重要作用,因此明确外泌体是否参与NDV感染过程中宿主天然免疫应答的启动十分必要。本试验补充了外泌体在NDV感染中发挥的作用,为阐明NDV在机体内的致病机制奠定了基础。