化脓隐秘杆菌耐药机制研究进展

徐菁岐，庄科勤，张 涵，卢殿杰，孟雨晴，付连军，沙万里，董文龙

(吉林农业科技学院动物科技学院，吉林吉林 132109)

化脓隐秘杆菌(Trueperellapyogen)是一种重要的条件致病菌，又名化脓放线杆菌、化脓棒状菌，属于隐秘杆菌属[1]。该菌常分布于牛、羊、猪等动物的黏膜上，可引起乳房炎、肝周炎、子宫炎等，对奶牛养殖业造成严重经济损失，且对人也有一定的致病性[2-4]。有关研究表明，其主要毒力基因有溶血素基因(plo)、神经氨酸酶基因(nanH与nanP)以及胶原结合蛋白基因(cpbA)[5]。近年来，化脓隐秘杆菌在我国上海、广东、四川、天津等地均有报道，该细菌病范围不断扩大，并且在日本、约旦等国家均有致病性方面的研究[6-7]。当前，青霉素、氨基糖苷类药物、杆菌肽等抗生素是临床治疗的首选药物，均能够对化脓隐秘杆菌有杀灭作用[8]。但是由于抗菌药物的长期使用，容易导致化脓隐秘杆菌耐药性及多重耐药性的发生而影响治疗效果。本文综述了近年来国内外化脓隐秘杆菌的耐药情况，并对化脓隐秘杆菌的耐药机制进行了总结，以期为临床用药提供科学参考。

1 化脓隐秘杆菌对6类常用抗生素以及抗菌药物的耐药性及耐药机制

目前，研究人员对化脓隐秘杆菌进行耐药试验，发现其对氨基糖苷类抗生素、大环内酯类抗生素、四环素类抗生素、磺胺类药物、β-内酰胺类抗生素以及酰氨醇类抗生素有耐药性。化脓隐秘杆菌的耐药性与染色体基因有关，同时也可通过质粒、整合子-基因盒系统等可移动元件从外界得到耐药基因，从而使化脓隐秘杆菌产生耐药性。

1.1 对氨基糖苷类抗生素的耐药性及耐药机制

氨基糖苷类抗生素是临床上常用的抗生素之一，对化脓隐秘杆菌有抑菌效果。但随着氨基糖苷类抗生素的不合理使用，细菌的耐药问题也随之出现[9]。2017年，Rezanejad M等[10]在患有乳腺炎和子宫炎的产后奶牛中共分离得到73株化脓隐秘杆菌并进行了药敏试验，发现分离菌株对庆大霉素产生严重的耐药现象，且分离于奶牛乳腺炎的菌株对链霉素具有较高耐药率，对不同临床表现的化脓隐秘杆菌病的防治提供了数据支持。研究证明，在该菌中检出率较高的Ⅰ类整合子中的基因盒存在5种可以诱导化脓隐秘杆菌对氨基糖苷类抗生素耐药的基因aadA1、aadA2、aadA5、aacA4与aad(6 ')-Ib，并且发现rbsB表达形成的核糖体结合蛋白(ribosomal protein，RbsB)可以通过影响生物膜形成等生理过程导致化脓隐秘杆菌对氨基糖苷类抗生素耐药[5]。另有研究表明，Kwiecien E等[11]对在分离株中发现的Ⅰ类整合子基因盒进行序列分析，发现aadA9、aadA11两种基因，分别编码了AadA9和AadA11，这两种蛋白介导化脓隐秘杆菌对链霉素和新霉素的耐药性，同时检测到其他未由基因盒携带的氨基糖苷类抗性基因，如strA-strB和aph(3')-Ⅲa。

1.2 对大环内酯类抗生素的耐药性及耐药机制

大环内酯类抗生素通过降低病原50S核糖体中肽酰转移酶的活性来抑制细菌蛋白质合成，从而阻止其分裂，并影响胞内代谢反应的进行，达到抑菌作用。Zastempowska E等[12]对从患有乳腺炎的奶牛分离得到的89株化脓隐秘杆菌进行体外药敏试验，结果显示其中1株菌株对红霉素有耐药性，其MIC值≥256 mg/mL，具有高耐药性，同时在五个分离株都检测到了耐药基因ermB。2019年，Galan-Relano N等[13]对从西班牙采集到的96株化脓隐秘杆菌分离株进行药敏试验，结果表明有22%的分离株对红霉素表现为不同程度的耐药。另外，已经发现有化脓隐秘杆菌对红霉素类衍生物及乙酰螺旋霉素等大环内酯类抗生素具有多重耐药性。例如，刘耀川等[14]对化脓隐秘杆菌分离株的相关耐药基因msrA、mefA、ermX和ermB进行了PCR扩增，并分析其核苷酸序列，发现对大环内酯类抗生素耐药的化脓隐秘杆菌中携带msrA(72.7%)及mefA(18.2%)。Tamai A T等[15]在从产后母牛分离到的65株化脓隐秘杆菌中,大环内酯类耐药基因ermB和ermX的检出率分别为27.7%和38.5 %。

1.3 对四环素类抗生素的耐药性及耐药机制

Zhang D X等[16]对可能存在于化脓隐秘杆菌中的耐药基因tetK、tetO、tetL以及tetM进行PCR扩增，并研究其在32株化脓隐秘杆菌分离株中的分布状况，发现在所有分离株中都携带tetK，其在染色体和质粒中存在率颇高，分别为53.1%和46.9%；在分离株中仅发现低量tetT(在染色体和质粒的存在率分别为9.4%和12%)和tetM(在染色体和质粒的存在率分别为12.5%和9.4%)；在所有分离株中未发现tetO以及otrA。2016年，Rzewuska M等[17]进行相关研究表明化脓隐秘杆菌中的毒力因子与耐药性存在一定的相关性，nanP可以使分离株对四环素的耐药性降低3倍。Kwiecien E等[18]对用四环素耐药基因rpp的通用引物扩增得到的15个基因片段进行检测，分析结果表明，所有扩增子都被识别为tet，该基因可能通过影响复制来介导耐药。而在通过对所有分离株进行系统进化树分析，发现不同分离株携带不同的tetW基因，如从猪上分离得到的化脓隐秘杆菌携带4种不同的tetW变体(包括tetW-1、tetW-2、tetW-3和tetW-4)，而畜用牛和欧洲野牛的分离株中只携带tetW-3，对猪源以及牛源化脓隐秘杆菌的耐药机制的区分提供了启示。

1.4 对磺胺类抗菌药物的耐药性及耐药机制

磺胺类药物可与对氨基苯甲酸(PABA)竞争二氢叶酸合成酶，阻碍二氢叶酸的合成，从而影响核酸的生成，抑制化脓隐秘杆菌的生长繁殖。2018年，Iradi A T等[15]对从德黑兰的产后奶牛分离得到的16株化脓隐秘杆菌进行药敏试验，发现其对甲氧苄啶-磺胺异恶唑(trimothoprim-surfacethoxazde，TMP-SMX)有高耐药性(72.3%)。张素辉等[19]对在山羊分离得到的化脓隐秘杆菌进行药敏试验，结果表明其对磺胺异恶唑表现出明显的耐药性。2019年，Galan-Relano N等[13]对从西班牙采集到的96株化脓隐秘杆菌分离株进行药敏试验，结果表明有89%的分离株对甲氧苄啶-磺胺甲基异恶唑不敏感，耐药现象较为普遍。Zhao K L等[20]在16株化脓隐秘杆菌检测到有部分菌株携带磺胺类耐药基因dfr2a。

1.5 对β-内酰胺类抗生素的耐药性及耐药机制

β-内酰胺类抗生素可以抑制胞壁转肽酶，使细胞壁合成障碍，也可以增加细胞壁自溶酶活性，产生自溶或胞壁质水解，是用于治疗化脓隐秘杆菌病最常见、最广泛的抗生素之一。2013年，刘耀川等[21]对32株化脓隐秘杆菌进行了β-内酰胺类抗生素耐药性研究，所有分离株均表现出不同程度的耐药，耐药率从高到低依次为头孢噻夫(75.0%)、氨苄西林(71.9%)、青霉素(68.7%)、苯唑西林(56.2%)以及阿莫西林(53.1%)。2017年，Rezanejad M等[10]研究表明，在取样的患有子宫炎和乳腺炎的奶牛中分离得到的菌株对青霉素和阿莫西林都有严重的耐药现象。Liu M C等[22]对奶牛子宫内膜进行取样并进行药敏试验，结果表明大约有37.5%至71.9%的化脓隐秘杆菌分离株对头孢菌素类抗生素有耐药性。Zhao K L等[20]在16株化脓隐秘杆菌检测到β-内酰胺类耐药基因blaP1(28.6%)。Santos T M A等[23]对从子宫液分离得到的化脓隐秘杆菌进行药物敏感性分析，发现有至少50%的分离株表现出对阿莫西林的耐药性。

1.6 对酰氨醇类抗生素的耐药性及耐药机制

氯霉素可作用于细菌核糖核蛋白体的50S亚基，阻挠蛋白质的合成，属抑菌性广谱抗生素。董文龙等[24]对我国吉林省8株猪源化脓隐秘杆菌进行MIC药敏试验，结果显示有2株对氯霉素耐药。Santos T M A等[23]对从子宫分离得到的化脓隐秘杆菌进行MIC药敏试验，结果表明所有分离株表现出对氯霉素不同程度的耐药。Liu M C等[22]对化脓隐秘杆菌中的Ⅰ类整合子进行研究，发现其中还有关于引起对氯霉素耐药的基因cmlA6。

2 其他耐药机制

在化脓隐秘杆菌抗生素耐药性的传播过程中，多种可移动元件发挥了重要作用。Dong W L等[25]发现介导化脓隐秘杆菌耐药的基因岛TGI1，此基因岛携带的1类整合子与化脓隐秘杆菌的多重耐药有关。Zhao K L等[20]通过PCR扩增得到Ⅰ类整合子内部携带的耐药基因盒，其中包括编码氨基糖苷类耐药基因(aacC、aadA1、aadA2)、编码β-内酰胺类耐药基因(blaP1)、编码磺胺类耐药基因(dfr2a)以及未知功能的基因(orfE)，表明Ⅰ类整合子的存在与化脓隐秘杆菌耐药性普遍一致，且整合子在其耐药性的传播中发挥了重要作用。同时，插入序列(insetion sequence，IS)还可以获取外源性耐药基因，如四环素耐药基因tet(33)可以通过IS6100水平转移获取[26]。韩雪在化脓隐秘杆菌分离株中检测出tnpA(41.18%)、IS26(61.76%)和tnp513(17.65%)3种转座子，且发现随着化脓隐秘杆菌耐药谱的扩大，转座子tnpA的阳性率亦增加，说明化脓隐秘杆菌耐药性产生或增加可能与转座子tnpA存在密切关系[27]。Duse A等[28]对从瑞典乳腺炎奶牛分离得到的化脓隐秘杆菌进行研究，其单峰MIC表明，该菌通常不会发生获得性耐药，说明化脓隐秘杆菌的耐药机制存在地区性差异。

3 展望

化脓隐秘杆菌的耐药性产生机制复杂多样，其与染色体基因有关，同时也通过质粒、整合子-基因盒系统等可移动元件从外界获得耐药基因，从而使化脓隐秘杆菌产生耐药性。其中对氨基糖苷类抗生素、大环内酯类抗生素、四环素类抗生素、磺胺类抗生素、β-内酰胺类抗生素以及酰氨醇类抗生素耐药现象最为严重。

化脓隐秘杆菌是牛呼吸道综合征和壁纤维蛋白性腹膜炎(Parietal fibrinous peritonitis，PFP)的主要致病菌之一，同时可以感染猪、羊、林麝等重要经济动物，并且能够感染人与伴侣动物[29-31]。现有抗生素品种有限，长期大量或不合理使用抗菌药物是造成不同种类抗生素的耐药性上升，我国农业农村部出台了各项政策，如何进行重要病原菌的无抗替抗防治成为科研工作者的研究重点。有研究发现，能够侵染化脓隐秘杆菌的噬菌体vB-ApyS-JF1，该噬菌体适用于化脓隐秘杆菌的防控[32]。高翔对木犀草素消减化脓隐秘杆菌对四环素类抗生素耐药性的机制进行研究，发现木犀草素对耐四环素类抗生素的化脓隐秘杆菌仍具有良好的体外抗菌活性，亚抑菌浓度(1/2 MIC)木犀草素能够消减化脓隐秘杆菌对四环素类抗生素的耐药性，同时木犀草素还可以通过抑制MsrA外排泵增加对大环内酯类抗生素的敏感性[33-34]。徐登峰等[35]进行了化脓隐秘杆菌候选抗原的免疫保护效果研究，确定免疫铁ABC转运体重组SBP的小鼠能抵御致死剂量的化脓隐秘杆菌攻击，表明该SBP是免疫原性良好的保护性抗原，可用于化脓隐秘杆菌亚单位疫苗的研发。Huang T等[36]研究出了以PLO联合免疫白细胞介素(IL-1β)为基础的DNA疫苗，用于增强易感动物对化脓隐秘杆菌的免疫力。抗菌肽具有抗菌谱广、热稳定性高等优点，希望可以更多的应用到化脓隐秘杆菌病的防治[37]。

国内对于化脓隐秘杆菌的各类耐药性相关基因研究并不多，因此，更加系统、全面地开展化脓隐秘杆菌耐药机制的研究，将对我国畜牧业生产和发展具有重要的意义。