结核分支杆菌外排泵蛋白研究进展

张 蕊，于 丹，李 东，徐金彪，时 坤，2，李健明，2，宗 颖，2，曾范利，2*

(1.吉林农业大学中药材学院，吉林长春 130118；2.吉林省梅花鹿高效养殖和产品开发技术工程研究中心，吉林长春 130118；3.长春市动物疫病预防控制中心，吉林长春 130061)

结核病(Tuberculosis，TB)是一种严重的人畜共患病[1]。从家畜到驯养野生动物，结核病的发病率居高不下，严重影响着畜牧业的发展[2]。而目前对于动物的有效治疗手段也是以抗结核药物联合广谱抗生素，并以不科学的药物剂量治疗患病家畜[3]。这也导致了结核分支杆菌获得性耐药，而耐药结核分支杆菌也是目前结核病的主要致病菌[4]。长期的耐药会诱发菌体的外排泵的改变，外排泵不仅维持菌体正常代谢，影响药物对菌的致死性，同时，在菌体生长致病力等方面均有发现。目前研究发现菌体外排泵家族主要有4大区域，即ABC家族、MFS家族、RND家族和SMR家族。本文将从结核分支杆菌耐药现状，结核分支杆菌外排泵与耐药、外排泵抑制剂对耐药结核病的治疗等方面，通过外排泵结构功能及其相关的最新研究，阐述外排泵与耐药的相关性。

1 结核分支杆菌耐药现状

结核分支杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)耐药性的产生是目前治疗结核病的一大障碍，世界卫生组织(WHO)将耐药类型分为单耐药、耐多药、多耐药、广泛耐药和利福平耐药5大类，并将耐多药结核病(multidrug-resistant tuberculosis，MDR-TB)确定为对人类公共健康的主要威胁[6]。MDR-TB是由至少对异烟肼和利福平耐药的Mtb引起的。据统计，2017年全球报告的55.8万结核病例为利福平耐药，其中82%为MDR-TB。目前，针对Mtb的感染与致病机理所研发的药物包括一线药物利福平、异烟肼、乙胺丁醇，吡嗪酰胺和链霉素以及二线药物喹诺酮类等[7]。在一线药物中，利福平、异烟肼和吡嗪酰胺具有杀菌作用，乙胺丁醇具有抑菌作用。临床上用以上4种一线药物治疗药物敏感性结核病，该方案治愈率达85%以上。尽管多种药物在体外非常有效，但是需要长时间的药物治疗，而滥用或错误使用结核病药物常常会导致菌株耐药从而进一步混淆治疗。有研究显示，用药时Mtb会引起自发的染色体突变，而不同药物作用机理不同，从而引起的耐药基因及变异率不同，在细菌复制期间，耐利福平或者异烟肼的概率高达1×108-9[8]。引起广泛耐药结核病(extensive drug-resistant tuberculosis，XDR-TB)的Mtb除了对异烟肼和利福平等一线药物耐药，对氟喹诺酮类等二线药物同样耐药，因此在大多数情况下XDR-TB无法治愈[9]。除通过改变药物靶标或前药激活酶的自发性染色体突变实现耐药外[10]，研究发现，在许多低水平抗性分离株中未发现这些突变，表明还可能涉及其他抗性机制，例如细胞壁提供的通透性屏障和外排系统活性的机制[11]。

2 结核分支杆菌外排泵与耐药

现有研究显示，耐药基因突变并不能完全解释分支杆菌耐药机制，Mtb中存在药物外排泵的表达可能是另一种重要的机制，并对细菌在巨噬细胞内的存活也很重要，它可以使细胞内的细菌免受酸化、有毒金属积累和氮氧反应中间产物的影响[12]。在耐药性的演变中发挥重要作用[13]。

外排在细菌中普遍存在，并负责原核和真核细胞的先天性和获得性耐药，是一种阻止药物分子进入细菌细胞的主动外排机制[14]。Mtb中存在大量的药物外排泵，并导致Mtb对许多抗结核药物产生内在耐药性，如氟喹诺酮类、四环素类、氨基糖苷类等。多药外排泵还可以排出多种化合物，如细菌代谢产物，植物产生的化合物，群体感应分子和毒力因子[15]。另一方面，许多证据表明外排泵在细菌中还具有生理功能，其表达受到各种环境和生理信号的严格调节，在细菌的新陈代谢、生理、营养物质、毒素、废物和信号分子的运输中起着重要作用[15]。

研究表明MDR外排泵通过多种方式促进细菌对药物的耐药性:①对一类药剂的固有耐药性；②对特定药剂的固有耐药性；③外排泵过表达而产生的阻力。并根据氨基酸序列同源性和底物特异性，一般将这些外排泵分为5大类[16]，即ATP结合盒家族(ATP binding cassette，ABC)、主要易化子超家族(major facilitator superfamily，MFS)、耐药性结节化细胞分化分子家族(resistance nodulation cell division，RND)、小多重耐药转运分子家族(small multidrug resistance family，SMR)和多药及毒性化合物外排家族(multidrug and toxic compound extrusion family，MATE)。所有的外排泵家族均由质粒或染色体编码，具有不同的结构形态与底物特异性，其中ABC、MFS、SMR、RND家族已经证实在Mtb中均存在。但RND家族多数存在于阴性菌中，在Mtb中较少[17]。

2.1 ATP结合盒家族外排转运蛋白

ABC家族转运蛋白主要以ATP为能量进行底物的转运，其成员是主要的活性转运蛋白，并利用ATP水解来挤出细胞毒性化合物。编码ABC转运体的基因占Mtb基因组的2.5%。至少有37个完整或不完整ABC转运体已经在Mtb中被发现。目前，已经证实ABC转运蛋白与药物耐受和病原菌的固有耐药具有很大的关联，并且负责氨基酸、糖类、金属离子、阴离子等的运输。氨基酸作为碳源和氮源，是细胞必不可少的组成部分，ATP结合盒转运蛋白家族发挥作用将促进Mtb对氨基酸的吸收，满足生长过程中的代谢需要。他们在宿主和病原体之间的代谢中起着重要作用[18]。例如，Rv1280c-Rv1283c为寡肽转运蛋白，其中Rv1281c的失活降低了细胞凋亡诱导能力和细胞因子IL-1b、IL-6和TNF-α的产生。Rv3666c-Rv3663c为二肽转运蛋白。Flores-Valdez等报道了Rv3666c-Rv3662c转运系统还参与并支持宿主体内Mtb存活的细胞内信号通路的调控。在Mtb的碳水化合物ABC输入系统的评估表明，它有4个碳水化合物ABC转运蛋白，即甘油磷酸胆碱的转运Rv2832c-Rv2835c、海藻糖的转运Rv1235-Rv1238、氨基糖转运Rv2316-Rv2318和Rv2038c-Rv2041c蛋白[19]。其中Rv2038c-Rv2041c蛋白包含一种预测是会引入碳水化合物的糖结合脂蛋白(SBP)，但尚未确定其确切的底物特异性[20]。ABC转运蛋白参与Mtb中必需营养物质的吸收，将有望在营养物质的运输途径中进行更多的研究，另外，ABC转运蛋白中还存在许多有价值的潜在表位Rv0986-Rv0987、SugA-B-C和Rv2937[21]，这最终将揭示出治疗这种破坏性疾病的新颖治疗策略[18]。

2.2 主要易化子超家族外排转运蛋白

MFS家族大多数成员为400个～600个氨基酸残基，由两种不同的蛋白结构域构成，即12碳和14碳跨膜结构，14碳跨膜结构由12碳跨膜结构与输水中央环组成[22]。可进行不同底物的转运，比如药物、有机阳离子和阴离子、糖等等[23]。用质子原动力(proton motive force，PMF)作为能源对底物同向、单向和反向连接中进行操做，大部分蛋白仍未鉴定，但其中一些蛋白已被证明具有多药物转运蛋白的功能。随后研究证明Rv1410c(p55)是一个射流泵，并对四环素和氨基糖苷类耐药。其他参与多药耐受的外排泵Rv0849、Rv1258c、Rv1877、Rv2459等也陆续被鉴定出来。Tap外排泵(Rv1258c)具有耐氨基糖苷类、大环内酯类抗生素的能力。许多Mtb中MFS成员的转运功能可在抗生素、化学试剂或金属离子条件下上调，如Rv1877、Rv3239c和Rv3728对四环素转运速率上调，Rv2846对异烟肼转运速率上调，Rv2994和Rv0037c对缬氨霉素转运速率上调，Rv0849对联吡啶转运速率上调，Rv0876c对ZnSO4转运速率上调等[24]，其中MFS转运蛋白Rv1258c和Rv0849还参与了耐多药[25]。从转录组数据来看，MFS家族转运蛋白在多种药物压力下都会发生转录水平的变化，但是这些影响MFS转运蛋白的抗菌物质是否为其底物还有待进一步的验证。

2.3 小多重耐药转运分子和耐药性结节化细胞分化分子家族等外排转运蛋白

SMR和RND家族是较小的家族，为次级运输工具，通常由质子动力供能。SMR转运蛋白是独立的最小的外排泵，具有100个～120个氨基酸和4个跨膜螺旋，它只有4个跨膜区，是H+偶联外排泵，前3个跨膜区具有双亲性，含有许多保守的氨基酸残基。这些残基的侧链与底物的疏水区直接作用来介导底物的跨膜转运。RND外排泵起质子/药物反转运蛋白的作用，主要存在于革兰氏阴性细菌中，尽管它们也存在于革兰氏阳性细菌[26]。与MFS相比，RND家族外排蛋白有更广泛的外排底物，对Mtb基因组研究发现，有13个跨膜蛋白被推测属于RND家族。由于这些蛋白仅限于在Mtb中发现，最终将它们命名为结核分支杆菌膜蛋白(MmpL)[27]。据报道，MmpL3、4、5、7、8、10和11参与细胞膜的生物合成[28-29]，此外，MmpL5和MmpL7有相关的抗结核药[30-31]。

3 外排泵抑制剂对耐药结核病的治疗

对外排泵的深入研究也促进了药物外排泵抑制剂的广泛研究与应用。通过对Mtb药物外排泵的功能鉴定和药物外排泵抑制剂的研发将有利于耐药性结核病的干预和治疗[24]。高效外排泵抑制剂(EPIs)可用作辅助治疗，基本上，外排泵的抑制作用可用于改善外排泵底物向细胞的转运，以及药物输送。研究发现，通过抑制外排泵基因表达实现外排抑制，从根源干扰药物外排泵的转录或翻译是抑制药物外排泵活性的有效策略[32]。基于竞争性地结合到药物外排泵的底物结合位点上并且外排出菌体，而原始的底物则留在菌体中实现杀菌作用的原理，研究开发了一大类肽模拟物，它们具有外排泵抑制剂的特性。该家族的第一个成员是MC-207-110，也称为苯丙氨酸精氨酸β-萘酰胺(PAβN)，但由于其毒性而在临床试验中失败。随后发现了喹啉衍生物，这些化合物成功的使耐药菌株对氯霉素、四环素和诺氟沙星敏感。根据相同的原理，具有多种侧链的衍生物，如烷基氨基、烷氧基、硫代烷氧基、氯喹啉等，在结构活性关系分析中显示出积极的结果。通过与相对应的抗生素竞争性抑制实现药物外排抑制。它们还具有有效药代动力学特征以及对透化和膜功能改变的最小副作用的优点[33]。

迄今为止，已显示出许多化合物可以作为Mtb外排系统的潜在抑制剂，EPIs来源目前大致分为三类，包括化学合成、微生物代谢和天然产物。也有大量离子通道阻滞剂的研究，例如吩噻嗪，硫代哒嗪和氯丙嗪以及苯烷基胺维拉帕米[34]。目前各种来源于化学合成、微生物代谢以及天然产物的各类第三代外排泵抑制剂有的已开发到Ⅱ/Ⅲ临床研究阶段，但多数还处于临床前阶段或体外试验，仍有难题需要去攻克。

4 展望

目前治疗结核病的一大难点就是耐药菌株的感染，在新药研发进展缓慢的局面下，仅靠重复使用现有药物很容易导致耐药菌株的产生，深入研究结核菌耐药机理及寻找新的药物靶标迫在眉睫。外排泵作为研究的一大热点，不仅仅参与物质代谢，在阻止药物进入菌体，保护菌体在宿主细胞中生存也至关重要。大量针对多药外排泵的研究有益于加深人们对细菌多药耐药性机制的认识，对外排泵结构功能的研究为后期更好地理解外排泵及与其他耐药机制之间的相互作用和开发安全有效的EPIs提供基础，这对提高抗菌药物的抗菌活性和改善临床治疗细菌感染疾病的现状具有重要的意义。期望随着对外排泵家族的深入研究，未来可以开发出用于临床控制耐药结核菌的药物，解决困扰人类健康的一大难题。