miRNA-17-5p在慢加急性肝衰竭合并乙型病毒性肝炎患者中的表达及与自噬相关蛋白表达的关系*

慢加急性肝衰竭(ACLF)是我国较为常见的一种肝衰竭，而乙型肝炎病毒(HBV)感染是其主要诱因，ACLF合并乙型病毒性肝炎又称HBV相关ACLF(HBV-ACLF)

。HBV-ACLF发病机制尚未十分明确，病情危重、病死率高、预后差，严重影响患者生存质量，已成为社会和家庭的沉重负担。研究表明，自噬在HBV-ACLF发病过程中发挥重要作用，且与病情程度有关

。Beclin1、微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ(LC3-Ⅱ)是两种自噬相关标志蛋白质，二者与肝祖细胞成熟分化有重要联系

。微小RNA-17-5p(miRNA-17-5p)可通过靶向自噬mRNA参与自噬调控

。然而目前关于miRNA-17-5p在HBV-ACLF患者中的表达研究较少，且miRNA-17-5p与自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ相关性的研究鲜有报道。因此，本研究通过探讨HBV-ACLF患者血清miRNA-17-5p与Beclin1、LC3-Ⅱ表达的相关性，初步探究miRNA-17-5p在HBV-ACLF患者自噬中发挥的作用，以期为临床上开发早期HBV-ACLF诊断指标提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2019年2月至2020年5月本院住院治疗的HBV-ACLF患者82例为HBV-ACLF组，男49例，女33例，平均年龄(36.26±12.36)岁；选取同期住院治疗的慢性乙型病毒性肝炎(CHB)患者79例作为CHB组，男45例，女34例，平均年龄(34.72±12.96)岁；另选取同期86例健康体检者作为对照组，男50例，女36例，平均年龄(35.79±12.89)岁。三组研究人群年龄、性别比较，差异无统计学意义(

>0.05)。试验经本院临床研究伦理委员会批准，符合伦理学要求。

按照改革实施方案，蹄疾步稳推进安顺农垦改革。以推动茶叶产业发展为主导方向，在原有的茶叶联盟基础上，以贵州省安顺市茶叶果树场为核心，依托安顺御茶村茶业有限责任公司的市场渠道和成熟技术，大力打造覆盖山京畜牧场等5家农垦农场和4家民营企业的安顺九龙山山脉区域3万多亩茶叶大基地。以安顺“瀑布茶”为平台，组建更紧密的区域性农垦茶叶实体集团，确保“安垦瀑布茶”品牌基地、加工、营销等持续发展。

1.2 纳入标准 ①CHB诊断符合CHB防治指南(2015年版)

，HBV-ACLF诊断符合《肝衰竭诊治指南(2012年版)》

，HBV-ACLF诊断要点为慢性肝病基础上4周内出现以下症状：消化道症状明显，乏力；失代偿腹水；黄疸明显，总胆红素大于正常值上限10倍；伴或不伴肝性脑病；排除其他凝血异常原因后凝血酶原活动度≤40%。②病例资料齐全。③一个月内未使用抗炎、免疫抑制剂。④患者均自愿参加研究，并签署知情同意书。

本文研制的是一种无机泡沫吸波材料，是利用碎玻璃或火山灰等为主要原材料，在其中添加电磁损耗物质，熔融发泡而成的一种隐身材料，如图7所示。

1.5.1 样品采集及保存 采集健康体检者体检当天及CHB、HBV-ACLF患者入院第2天清晨空腹静脉血，3 000 r/min离心15 min后收集血清，置于-80℃保存待测。

1.5.2 血清miRNA-17-5p水平测定 采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测受试者血清miRNA-17-5p表达水平。采用RNA提取试剂盒提取血清总RNA，反转录试剂盒将RNA反转录得cDNA。采用qRT-PCR仪对miRNA-17-5p及其内参U6进行扩增。反应体系共10 μl：cDNA模板(50 ng/μl)1 μl，正反向引物(10 μmol/L)各0.4 μl，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)5 μl，ddH

O 3.0 μl，Rox reference dye(50×)0.2 μl，引物由上海生工生物工程股份有限公司设计并合成，引物序列见表1。反应条件：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，45个循环。每个样品重复3次，采用2

法计算血清miRNA-17-5p相对表达量。

2.2 3组受试者总胆红素、白蛋白、HBV DNA载量比较见表3。

1.3 排除标准 ①伴有人免疫缺陷病毒或其他病毒感染者；②遗传代谢性肝病、自身免疫性肝病、药物性肝损伤、酒精性肝病者；③伴有肾脏疾病、肾功能不全者。

1.4 主要试剂与仪器 Beclin1 ELISA试剂盒(货号：MM-13158H1)、LC3-Ⅱ ELISA试剂盒(货号：MM-2005H1)均购自武汉益普生物科技有限公司；总胆红素ELISA试剂盒(货号：QTE20094)购自上海乾途生物科技有限公司；白蛋白ELISA试剂盒(货号：KA0454)购自上海群己生物科技有限公司；RNA提取试剂盒(货号：JL1545)购自德国QIAGEN公司；反转录试剂盒(货号：toyobo/FSQ-301)购自上海研卉生物科技有限公司；Rox reference dye(货号：AAT-400-E)购自艾美捷科技有限公司；SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(货号：RR820A)购自上海善然生物科技有限公司；HBV核酸定量检测试剂盒(PCR荧光探针法)(货号：20163401365)购自杭州艾康生物技术有限公司；qRT-PCR仪(型号：Stratagene Mx3005P)购自上海普迪生物科技有限公司。

1.5.3 血清自噬相关蛋白、总胆红素、白蛋白水平检测 采用酶联免疫吸附(ELISA)法检测各组血清自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ及总胆红素、白蛋白水平，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.5.4 血清HBV DNA载量检测 血清HBV DNA载量测定采用PCR结合荧光探针的体外扩增技术。HBV引物序列P1：5′-ATCCTGCTGCTATGCCTCATCTT-3′，P2：5′-ACAGTGGGGGAAAGCCCTACGAA-3′，荧光探针序列：5′-TGGCTCAGTTTACTAGTGCCATTTG-3′，引物及探针由中山医科大学达安基因诊断中心合成。提取DNA后，按照荧光探针HBV DNA定量检测试剂盒说明书操作，之后放入qRT-PCR仪扩增。反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性30 s，58 ℃退火1 min，45个循环。反应结束后，电脑分析并计算出HBV DNA拷贝数。

有人说：戏剧的本质就是冲突。矛盾冲突是构成戏剧情境的基础，是展现人物性格、反映生活本质、揭示作品主题的重要手段。教学时抓住了矛盾冲突等于找到了戏剧的正确“打开方式”，剖析矛盾冲突，对品析人物性格，走进人物内心，乃至演好剧本都将起到至关重要的作用。

正如保罗·莱文森所提出的媒介演进的“人性化趋势”［6］理论，随着智媒时代的到来，媒介会越来越人性化，AI 技术会随着用户需求的变化不断完善。同时，彭兰教授也提到媒介的“自我进化”［5］，人机合一的模式会使机器具有洞察人心的能力，而人对机器的驾驭能力也互为推进。那么人如何把握机器？人的价值如何体现？这些问题需要我们时刻思考。技术的发展要求媒体工作者进一步提升自身素质，具备组织人工智能、“应用”大数据等新兴技术的能力。

2 结果

2.1 3组受试者血清miRNA-17-5p、Beclin1、LC3-Ⅱ水平比较 见表2。

1.5 研究方法

2.4 血清miRNA-17-5p、Beclin1、LC3-Ⅱ水平对HBV-ACLF的诊断价值 以血清miRNA-17-5p、Beclin1、LC3-Ⅱ水平为检验变量绘制ROC曲线，结果显示，血清miRNA-17-5p、Beclin1、LC3-Ⅱ水平诊断HBV-ACLF的曲线下面积(AUC)分别为0.862(95%

:0.806～0.918)、0.784(95%

: 0.715～0.853)、0.886(95%

: 0.836～0.935)，截断值分别为1.311、10.192 ng/ml、58.416 ng/ml，特异性分别为88.4%、80.2%、81.4%，敏感度分别为74.4%、63.4%、81.7%；三者联合诊断的AUC为0.915(95%

: 0.869～0.961)，特异性为88.4%，敏感度为82.9%，见图3。

2.3 HBV-ACLF患者血清miRNA-17-5p与Beclin1、LC3-Ⅱ、总胆红素、白蛋白、HBV DNA载量的相关性 Pearson相关性分析结果显示，HBV-ACLF患者血清miRNA-17-5p水平与Beclin1、LC3-Ⅱ呈负相关(

=-0.580、-0.511；均

<0.05)，见图1、2。HBV-ACLF患者血清miRNA-17-5p与总胆红素、HBV DNA载量均呈负相关，与白蛋白呈正相关(

<0.05)；Beclin1、LC3-Ⅱ与总胆红素、HBV DNA载量均呈正相关，与白蛋白呈负相关(

<0.05)，见表4。

目前，常用的沙门氏菌检测方法有传统方法如国家标准、AOAC等，以免疫学为基础的检测方法如酶联免疫法（ELISA）等，以分子生物学为基础的检测方法如聚合酶链式反应（PCR） 等[6]。传统方法培养时间较长，一般需要3～4 d检测时间[7]。ELISA方法从样品的制备到检测结束大概要40～48 h才能完成，且由于使用的多价血清存在不同程度的交叉反应，容易产生假阳性[8]。PCR方法需要昂贵的PCR仪器和繁琐的电泳，故不宜普遍推广。因此，亟需开发一种快速检测食品中沙门氏菌的检测方法，对于保障我国食品安全具有重要意义。

2.5 影响HBV-ACLF发生的多因素Logistic回归分析将是否发生HBV-ACLF作为因变量，以miRNA-17-5p、Beclin1、LC3-Ⅱ、总胆红素、白蛋白、HBV DNA载量为自变量进行Logistic回归分析，结果显示Beclin1、HBV DNA载量是影响HBV-ACLF发生的独立危险因素(

<0.05)，miRNA-17-5p水平是影响HBV-ACLF发生的保护因素(

<0.05)，见表5。

1.名词适用应统一。行政院提出之草案版本名称为“纠缠行为防制法”，而立法委员提出之草案版本名称为“跟踪骚扰防制法”。为贴近一般大众所能理解的反复、持续侵扰情形，建议应将名词统一，以避免名词解释上模棱两可。

3 讨论

肝衰竭是肝病的一种类型，多数肝衰竭患者发病与HBV感染有关

。HBV-ACLF是在CHB基础上，短期迅速发展，出现肝功能失代偿，进而出现凝血功能障碍、肝性脑病、高胆红素及腹水等表现的一组临床症候群

。HBV-ACLF临床表现多样，治愈率极低，因此早发现、早诊断、早评估，进而采取积极有效的应对办法仍是目前HBV-ACLF诊疗过程中亟待解决的医学难题。

肝细胞坏死和再生障碍是HBV-ACLF的发病机制之一，而肝细胞自噬也可能是其机制之一

。Beclin1定位于人染色体17q21，是调节自噬现象的关键蛋白质，且能与线粒体结合促进线粒体细胞色素C释放，进一步促进细胞凋亡

。LC3-Ⅱ位于自噬的双层膜上，主要参与自噬体的伸展与延长，是一种常用于检测自噬水平的分子标志物

。本研究结果显示，HBV-ACLF患者血清Beclin1、LC3-Ⅱ水平高于CHB患者和健康人群，CHB患者血清Beclin1、LC3-Ⅱ水平高于健康人群，与梁振国等

研究结果基本一致。提示肝脏疾病患者血清Beclin1、LC3-Ⅱ水平可能随患者病情加重而升高，其可能是由于疾病发生后细胞凋亡过程中激活的相关蛋白可剪切Beclin1，剪切后形成的C端Beclin1可启动自噬，参与自噬体的合成，而被激活的LC3-Ⅱ参与自噬体的伸展与延长，影响患者病情进展。

miRNA是长度为18～25个核苷酸的内源性、非编码的单链小RNA分子，可参与细胞凋亡、自噬等多种过程的调控，在循环中稳定存在

。洪丹彤等

研究表明，miRNA-17-5p可靶向自噬相关蛋白，进而调控巨噬细胞抗结核分歧杆菌感染。本研究结果显示，HBV-ACLF患者血清miRNA-17-5p水平低于CHB患者和健康人群，且与Beclin1、LC3-Ⅱ呈负相关，Beclin1、miRNA-17-5p均是影响HBV-ACLF发生的因素。推测HBV感染过程中，miRNA-17-5p下调后可能通过靶向上调Beclin1表达水平，并且增加LC3-Ⅱ表达水平，进而促进自噬体的合成及其与溶酶体的结合，增强自噬作用，最终对患者病情进行调控。且本研究ROC结果显示，miRNA-17-5p、Beclin1、LC3-Ⅱ三者对HBV-ACLF均有一定的诊断价值，且三者联合诊断价值较高，临床中可参考三者截断值水平，对患者病情进行初步诊断。临床研究表明，总胆红素、HBV DNA载量均是反映肝脏疾病肝功能及病毒载量情况的重要指标

。而本研究结果中miRNA-17-5p、Beclin1、LC3-Ⅱ与总胆红素、HBV DNA载量均呈一定的相关性，进一步提示miRNA-17-5p可能通过调控Beclin1、LC3-Ⅱ表达影响自噬水平，参与肝脏疾病的发展及肝功能的调节。

综上所述，HBV-ACLF患者血清miRNA-17-5p表达水平升高，且与自噬相关蛋白Beclin1、LC3-Ⅱ均呈一定的相关性。表明HBV-ACLF可能与自噬处于异常激活状态有关，而miRNA-17-5p可能通过影响自噬水平参与HBV-ACLF病情的发生、发展。但因本研究收集受试者样本量有限，结果可能存在一定的局限性，且miRNA-17-5p参与HBV-ACLF的机制尚需进一步深入研究。

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