基于拉曼光谱技术的冷鲜牛肉高铁肌红蛋白及其酶活性检测

张同刚，韩斌，李静

（泰山学院生物与酿酒工程学院，山东 泰安 271000）

肉色是影响消费者对肉及其制品购买欲望的首要因素之一[1-2]。动物宰后的胴体颜色主要是由3种不同氧化形态的肌红蛋白相对含量来决定的[3-6]。阮振甜等[7]研究秦川牛宰后肉色与其肉质品质的相关性，得出在胴体排酸过程中，亮度值与红度值先上升后下降。赵莉君等[8]研究保鲜膜包裹对贮藏中冷鲜肉肉色的影响，得出保鲜膜有助于肉色的稳定性。黄辉凤[9]研究肉色与血红蛋白浓度的相关性研究，探讨血红蛋白作为猪肉品质关键性状肉色稳定性的间接性、标志性指标，为今后活体动物肉色无损预测提供科学数据与技术支撑。拉曼光谱技术能体现分子的振动或转动信息，通过峰的位置、强度、形状等信息[10-14]，反映被测样品分子的官能团或化学键的特征振动频率，提供散射分子的结构信息，用于检测不同状态食品分子结构的变化[15-22]。

本文旨在通过以冷鲜牛肉为研究对象，基于拉曼光谱技术，建立一种适用于冷鲜牛肉表面高铁肌红蛋白相对含量与其还原酶活性的无损、快速检测方法，为冷鲜牛肉贮藏过程中肉色褐变速率及控制方法提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛背最长肌：宁夏盐池县大夏农林牧开发有限公司；乳酸、蔗糖、高铁氰化钾、盐酸、磷酸二氢钠、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic，EDTA）、还原型辅酶Ⅰ（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotid，NADH）、三羟甲基氨基甲烷盐酸盐[Tri（hydroxymethyl）amino methane hydrochloride，Tris-HCl]缓冲液（均为分析纯）：宁夏西夏生物试剂公司；马心肌红蛋白溶液：美国Sigma公司。

1.2 仪器

Inspector 300拉曼光谱仪：美国赛普斯公司；HH.SY21-Ni6-C高速组织捣碎机：江苏金坛市亿通电子有限公司；UV-1200紫外分光光度计：上海美谱达仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

选取宁夏本地2岁～3岁龄的鲁西黄牛作为研究对象。宰后，立刻将背最长肌从修整好的胴体取下，在0℃～4℃的环境中真空包装储存；取5 mL马心肌红蛋白溶液，加入 50 mg K3[Fe（CN）6]反应 15 min，然后离心10 min（3 500 g、4 ℃），上清液通过 Tris-HCl缓冲液（4℃、50 mmol/L、pH 7.0）透析除去溶液中多余的K3[Fe（CN）6]，即得到高铁肌红蛋白（metmyoglobin，MetMb）溶液。

1.3.2 高铁肌红蛋白相对含量的测定

参照Krzywicki[23]的方法，取待测样品表面肉样1 cm×1 cm×0.5 cm，加入25 mL浓度为0.04 mol/L，pH值为6.8的磷酸缓冲液，在（20±5）℃下均质30 s。避光保存1 h后，离心静置，取其上清液过滤，用分光光度计在525、545、565、572 nm处测量其吸光度。计算公式如下。

式中：P 为高铁肌红蛋白的质量分数，%；R1、R2、R3分别为吸光度比值 A572/A525、A565/A525、A545/A525。

1.3.3 高铁肌红蛋白还原酶活性的测定

1.3.3.1 高铁肌红蛋白还原酶粗酶液提取

参照Mikkelsen等[24]的方法，取样品表面肉样1cm×1 cm×0.5 cm，加入20 mL 2.0 mmol/L的磷酸盐缓冲液，pH7.0、4℃下均质处理1 min，在12 000 r/min下离心15 min，过滤后，加入 K3[Fe（CN）6]使其溶液浓度过饱和，发生氧化反应，随后用2.0 mmol/L的磷酸盐缓冲液透析 24 h（4℃，pH 7.0）。

1.3.3.2 还原酶活性测定

参照Mikkelsen等[24]的方法，在室温（20± 5）℃，配制pH6.4标准反应混合物，成分如表1所示，空白对照以去离子蒸馏水代替NADH，其它组分不变。

表1 标准反应混合物Table 1 Standard reaction mixture

反应自加入NADH而开始，用分光光度计在580nm波长下进行扫描记录吸光值。在580 nm波长下氧合肌红蛋白（oxymyoglobin，MbO2）与 MetMb的吸光值相差最大，二者的摩尔消光系数：12×103L/（mol·cm），通过比较反应前后（在反应线性阶段）吸光值的变化，便可计算出MetMb的还原酶活性，计算公式如下。

式中：A0为提取液加入NADH时580 nm下的吸光值；A1为提取液加入NADH 1 min后580 nm下的吸光值；V1为反应体系体积，mL；ε为摩尔消光系数，L/（cm·mol）；V2为样品体积，mL；l为比色杯光径，cm；m为样品的质量，g。

1.3.4 拉曼光谱测定

取冷鲜牛肉样品表面肉样2 cm×2 cm×0.5 cm置于Inspector 300拉曼光谱仪镜头下进行测定，激光波长为785 nm，功率为10 mW，扫描范围为400 cm-1～1 700 cm-1，聚焦深度为 200 μm。试验用 Savitzky-Golay平滑滤波方法进行拉曼光谱数据曲线平滑处理，采用8点平滑。

1.4 数据处理

光谱数据通过Unscrambler X 10.3（CAMO Software AS，OSLO，Norway）软件处理。选取偏最小二乘回归方法建立模型，采用校正集、交互验证、预测集决定系数、剩余预测偏差、均方根校正、交互验证、预测误差进行评估。模型最后采用交互验证进行评价。

2 结果与分析

2.1 表面高铁肌红蛋白相对含量及其还原酶活性的测定

选取120个样本作为试验对象，随机选取其中的100个样本作为试验的校正集，其余的20个样本作为试验的预测集，并将样本中的最大值和最小值放入试验校正集中，确保校正集的容括性，不同高铁肌红蛋白相对含量及其高铁肌红蛋白还原酶活性见表2。

表2 高铁肌红蛋白相对含量及其还原酶活性Table 2 The relative content of MetMb and MRA of beef meat samples

2.2 光谱数据分析

冷鲜牛肉样品表面原始拉曼光谱扫描结果如图1所示。

图1 冷鲜牛肉样本表面的原始拉曼光谱图Fig.1 Raw Raman spectroscopy of fresh beef samples

由图1可知，拉曼位移570 cm-1的峰归属于高铁肌红蛋白中铁离子和氧气间化学键的（Fe-O2）伸缩振动，当570 cm-1附近的拉曼光谱峰强度开始减弱时，表明高铁肌红蛋白中铁离子和氧气间化学键开始发生断裂，此时高铁肌红蛋白的相对含量开始逐渐增加；样品原始光谱数据中还包含了一些无关的干扰因素（暗电流、背景光等），使得拉曼光谱的曲线出现一定的基线漂移，本试验利用常见光谱数据预处理方法，改善建模效果，减少干扰信息，结合偏最小二乘回归法（partial least squares regression，PLSR）建立模型，比较分析特征波段与全波段建立模型的效果。

2.3 光谱预处理

选择最佳的光谱预处理方法，对开始采集的原始光谱数据使用多元散射校正（multiplicative scattering correction，MSC）、归一化（normalization，Nor）、移动平均平滑（moving average，MA）、S-G 卷积平滑（savitzkygolay，SGS）、标准正态化（standard normalized variate，SNV）、中值滤波（median filter，MF）、一阶导数（first derivation，1st Der）方法进行预处理分析，选取PLSR建立冷鲜牛肉表面的MetMb相对含量与高铁肌红蛋白还原能力（metmyoglobin reducing activity，MRA）的预测模型，并与原始光谱数据进行比较，见表3。

表3 冷鲜牛肉样品表面MetMb相对含量与MRA的原始光谱和预处理光谱的偏最小二乘回归模型Table 3 PLSR models for predicting the relative content of MetMb and MRA on the surface layer of beef samples with raw and pre-treated spectral data

续表3 冷鲜牛肉样品表面MetMb相对含量与MRA的原始光谱和预处理光谱的偏最小二乘回归模型Continue table 3 PLSR models for predicting the relative content of MetMb and MRA on the surface layer of beef samples with raw and pre-treated spectral data

由表3可知，MetMb经Nor预处理后的拉曼光谱数据建立的预测模型，其R2c和R2p分别为0.825和0.914，均高于其它光谱预处理方法建立的预测模型，且RMSEc和RMSEp分别为0.805与0.723均低于其它光谱预处理模型。通常一个好的模型应该是具有较高的R2值、较低的RMSEc和RMSEp值，且RMSEc和RMSEp差异也是越小越好。因此，选取Nor法作为MetMb的光谱预处理方法。

MRA经SGS预处理后的拉曼光谱建立的预测模型，其R2c和R2p分别为0.782和0.917，均高于其他光谱预处理方法建立的预测模型，且RMSEc和RMSEp分别为0.799与0.827均低于其他光谱预处理模型，因此，选SGS作为MRA的光谱预处理方法。MetMb经Nor预处理和MRA经SGS预处理后的相对分析误差值（relative percent deviation，RPD） 分别为 4.835与4.183，均大于2.5，表示了良好的预测能力。

2.4 特征波长的提取

原始光谱数中存在216个波段，信息量大，处理时间冗长，其中400 cm-1～900 cm-1光谱曲线存在较大的噪音干扰，因此选择900 cm-1～1 700 cm-1光谱中提取特征波长，使光谱信息集中在几个特征波段内。MetMb选择 8 个特征波长：928、989、1 040、1 107、1 230、1 412、1 473、1 556 cm-1；MRA 选择 9 个特征波长：989、1 040、1 182、1 240、1 360、1 442、1 535、1 650、1 667cm-1。冷鲜牛肉表面高铁肌红蛋白相对含量与高铁肌红蛋白还原酶活性的权重系数图见图2。

图2 冷鲜牛肉表面高铁肌红蛋白相对含量与高铁肌红蛋白还原酶活性的权重系数图Fig.2 Weight coefficient of the relative content of MetMb and MRA on the surface layer of fresh beef

由图 2（a）可知，928、989、1 040、1 107、1 230 cm-15个特征波长的光谱反射值与MetMb相对含量呈负相关，而 1 412、1 473、1 556 cm-1处的光谱反射值与MetMb相对含量呈正相关；图2（b）为冷鲜牛肉表面高铁肌红蛋白还原酶活性权重系数图，其中989、1 182、1 360、1 535、1 650、1 667cm-1的光谱反射值与 MRA 呈负相关，而1 040、1 240、1 442cm-1处的光谱反射值与MRA呈正相关。由分子振动量子理论可知，分子基团振动方式不同，其吸收波长特征频率不同，每种物质分子所含基团种类多且差异性强，因此具有特定的波段吸收组合。

2.5 全波段和特征波段下的PLSR模型比较

为对比全波段与特征波段下冷鲜牛肉表面MetMb相对含量与MRA模型的差异性，验证提取的特征波长的有效性，试验数据见表4。

表4 全波段和特征波段下的PLSR模型结果Table 4 The PLSR model results under full-wave bands and optimal wavelengths

由表4可知，MetMb相对含量特征波段下的PLSR模型的R2C为 0.827，R2P为 0.916，RPD为 4.893，特征波段校正集与验证集均高于全波段，且由交互验证的R2CV与RMSEcv值显示模型稳健性好；MRA特征波段下 PLSR 模型的 R2C为 0.802，R2P为 0.832，RPD 为4.115，与全波段的模型得到的决定系数差异不大，交互验证结果显示预测结果与参比值的偏离值在允许范围内，模型预测性较好，特征波段下的PLSR模型建立仅需8个～9个波段光谱反射值，与全波段216个波段相比，极大降低了数据冗余量与处理时间，为实现在线快速检测提供技术条件。通过上述分析，特征波段可以替代全波段光谱数据来建立预测模型。

3 结论

本文利用拉曼光谱技术结合化学计量学方法，建立了冷鲜牛肉表面MetMb相对含量与MRA的PLSR预测模型。选择900 cm-1～1 700 cm-1波段，进行原始光谱与不同光谱预处理方法比较，得出MetMb经Nor预处理与MRA经SGS处理后能取得较好的校正模型与预测模型。利用PLSR结合加权β系数选择特征波段，MetMb 相对含量的特征波段为 928、989、1 040、1 107、1 230、1 412、1 473、1 556 cm-1；MRA 的特征波段为989、1 040、1 182、1 240、1 360、1 442、1 535、1 650、1 667 cm-1，特征波段提取与分子基团光谱吸收峰值具有一定相关性。利用特征波段建立的PLSR模型，R2MetMb=0.916，RMSEpMetMb=0.827，RPDMetMb=4.893；R2MRA=0.832，RMSEpMRA=0.905，RPDMRA=4.115，可以替代全波段建立的PLSR模型，表明拉曼光谱技术结合化学计量学方法，预测冷鲜牛肉表面高铁肌红蛋白含量与高铁肌红蛋白还原酶活性是可行的。