来凤藤茶中二氢杨梅素的纯化工艺研究

樊庆涛，罗微，刘梁，赵玲，刘华英，子文杰，陈新*

（1.武汉轻工大学生命科学与技术学院，湖北 武汉 430023；2.湖北来凤腾升香料化工公司，湖北 恩施 445700；3.深圳市樱落科技有限公司，广东 深圳 518000）

藤茶，为葡萄科（Vitaceae）蛇葡萄属（Ampelopsis Michx.）显齿蛇葡萄 [Ampelopsis grossedentata（Hand.-Mazz）W.T.Wang]的嫩叶，经传统加工揉制、干燥而成[1]。在享有中国土家第一县美誉的湖北省来凤县，藤茶更是拥有上百年的应用历史。当地村民除将其作为茶日常饮用外，也使用它来治疗内部炎症、腹泻等常见疾病[2]。藤茶作为一种新资源食品，其主要活性成分为二氢杨梅素（dihydromyricetin，DMY），除具有黄酮类化合物的一般活性外，还具有解除醇中毒、预防酒精肝、脂肪肝、抑制肝细胞恶化、降低肝癌发病率等作用[3]。目前，国内对藤茶的研究较多，但现有针对藤茶中二氢杨梅素的纯化工艺相对繁琐，耗时长、成本高[4]。本文以来凤藤茶为原料，尝试开发一种高效、低成本的藤茶二氢杨梅素生产工艺，为促进其产业化发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

藤茶：湖北来凤腾升香料化工公司；无水乙醇（分析纯）:国药集团化学试剂有限公司；二氢杨梅素标准品：上海源叶生物科技有限公司；磷酸（色谱纯）：天津赛孚瑞科技有限公司；甲醇（色谱纯）：美国TEDIA天地试剂公司；大孔吸附树脂（D101、HPD-100、S-8、AB-8）：东鸿化工有限公司。其他试剂均为分析纯；试验用水为二次蒸馏水。大孔吸附树脂具体参数见表1。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪（Agilent-1260）：美国安捷伦公司；傅里叶红外光谱仪（Nicolet iS10型）：美国赛默飞世尔公司；有机微孔滤膜（0.22 μm）：上海兴亚净化材料厂；摩尔超纯水器（细胞型-1810A）：重庆摩尔水处理有限公司；旋转蒸发仪（V-855）：瑞士Buchi公司；电子天平（XS204）：美国梅特勒托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 DMY高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）标准曲线的建立

精准称取DMY标准品10 mg，用无水乙醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，制成浓度为0.2 mg/mL的标准品母液，分别用移液枪吸取 1、2、4、6、8、10 mL 标准品母液，用无水乙醇定容至10 mL容量瓶中，配成6个浓度梯度的标准品溶液[5-6]。

色谱柱：Agilent C18（5 μm，4.6 mm × 250 mm）；流动相：甲醇-0.03%磷酸，梯度洗脱（0 min～25 min，甲醇-0.03%磷酸体积比 12 ∶88；25 min～35 min，甲醇-0.03%磷酸体积比 65 ∶35；35 min～40 min，甲醇-0.03%磷酸体积比12∶88）；检测波长290nm；流速0.7mL/min；柱温 35℃[7]。

分别将6个浓度梯度的标准品溶液过0.22 μm有机微孔滤膜，装入进样瓶，分别进样10 μL，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，得标准曲线。

1.3.2 来凤藤茶总黄酮的提取及预处理

取来凤藤茶 2 000 g，在料液比 1∶15（g/mL）、乙醇浓度80%、提取温度80℃、时间3 h的条件下，水浴加热提取2次，合并提取液[8]，取1 mL用HPLC测量浓度。将提取液旋蒸浓缩至无醇味后得浸膏，加入5倍体积的蒸馏水混悬，然后分别用等体积的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯及正丁醇萃取，分别取样测定各萃取部位中DMY的浓度[9-10]。

1.3.3 静态吸附试验筛选大孔吸附树脂

选择 D101、HPD100、S-8、AB-8 4 种不同极性的大孔吸附树脂进行静态吸附试验，预处理后用滤纸吸干表面水分，分别称取10 g装入锥形瓶中。加入100 mL浓度为50 mg/mL的DMY溶液，分别在0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、8.0 h取样，分别测量上清液中DMY浓度[11]。待上清液DMY浓度无变化时，确认为树脂吸附饱和。用滤纸吸干表面水分，平均分4等份，分别用30%、50%、70%、90%乙醇解吸，于 0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 h 取样，分别测量上清液中DMY浓度，统计结果计算吸附量和解吸率[12]。

式中：Q 为吸附量，mg/g；D 为解吸率，%；M0为上样液中DMY的质量，g；M1为上清液中DMY的质量，g；M2为解吸液中DMY的质量，g；M3为解吸时上清液中DMY的质量，g；S1为树脂的质量，g。

1.3.4 动态试验确定洗脱溶剂

选取静态吸附试验选出的树脂，预处理后湿法装入10 cm×100 cm层析柱中，用水平衡。采用干法上样方式将萃取浸膏于10%乙醇中与大孔吸附树脂以质量比1∶1混匀，平均分成4等份，用水洗至无色无醇味无黄酮泄露后，分别以30%、50%、70%、90%乙醇为起点进行梯度洗脱，流速控制在80 mL/min。以甲酸∶二氯甲烷 ∶乙酸乙酯（1∶4∶5，体积比）为展开剂，DMY标准品做对照，用薄层色谱法（thin—layer chromatography，TLC）监测洗脱[13-14]，收集洗脱液，浓缩、真空干燥后得晶体粉末。

1.3.5 DMY样品的纯度测定

取制备所得的晶体粉末采用1.3.1中的HPLC条件进行纯度测定[15-20]。

2 结果与分析

2.1 来凤藤茶提取液的预处理结果分析

按照1.3.1的方法绘制DMY标准曲线结果见图1。

图1 二氢杨梅素标准曲线Fig.1 The standard curve of DMY

由图1可知，标准曲线方程为y=34036x+20.292，R2=0.999 7，通过HPLC检测，提取液中的DMY浓度为3.95 mg/mL。对4个萃取部位萃取液和剩余水溶液分别用HPLC分析，结果见图2。

图2 不同溶剂萃取液中DMY的含量Fig.2 The content of DMY in different solvent extracts

由图2可知，萃取后的DMY分别分布在二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇中，石油醚和剩余部分未检出DMY，其中乙酸乙酯部位DMY含量最高，占总量的96%。

2.2 大孔树脂静态吸附筛选结果

4种大孔树脂预处理后，进行DMY的静态吸附试验，计算得各树脂对DMY的吸附量与解吸率，结果见图3～图7。

图3 静态吸附吸附量结果Fig.3 Results of static adsorption capacity

图4 30%浓度乙醇溶液解吸率结果Fig.4 Results of resolution rate of 30% ethanol solution

图5 50%浓度乙醇溶液解吸率结果Fig.5 Results of resolution rate of 50% ethanol solution

图6 70%浓度乙醇溶液解吸率结果Fig.6 Results of resolution rate of 70% ethanol solution

图7 90%浓度乙醇溶液解吸率结果Fig.7 Results of resolution rate of 90% ethanol solution

由图3可知，树脂S-8吸附效果最好，吸附量最高可达18.0 mg/g；HPD-100和AB-8次之，吸附量为14.1 mg/g；D101吸附效果较差，最高吸附量仅为9.1 mg/g。由图4～图7可知，当乙醇作为洗脱液解吸时，大部分DMY均可被洗脱下来。随着乙醇浓度的增大，解吸率变化不大，除S-8的解吸率较低，在69%～73%之间，其余3种树脂对DMY的解吸率均在80%～87%范围内。结合树脂对DMY的吸附与解吸附效果，选择HPD-100树脂进行动态吸附试验。

2.3 大孔树脂动态吸附结果

HPD-100大孔树脂动态吸附结果见表2，4组试验分别以不同浓度乙醇作为起点梯度洗脱，利用TLC监测洗脱结果见图8。

表2 不同浓度乙醇溶液洗脱对比Table 2 Comparison of different concentrations of ethanol solution elution

图8 不同浓度乙醇洗脱薄层色谱图Fig.8 TLC of different concentration ethanol elution

由图8可以看出，在每组的洗脱试验中，DMY都集中在最开始使用的洗脱剂的洗脱液中。虽然高浓度乙醇可以以更少的柱体积洗脱出DMY，但低浓度的乙醇洗脱可以得到纯度更高的样品。试验表明，高浓度乙醇洗脱下的洗脱液杂质较多，浓缩时易起泡，增加控制难度，不利于产业化生产。但低浓度乙醇与之相反，在浓缩过程中随着乙醇浓度降低，样品会主动结晶析出，可得到纯度大于95%的DMY样品，有利于简化生产过程中的后期处理。

2.4 DMY纯度测定

将提取的DMY样品与标准品HPLC图谱比对如图9～图10，在相同保留时间下，通过计算峰面积比值得样品纯度为95.4%。

图9 DMY标准品液相色谱Fig.9 Liquid chromatogram of DMY standard

图10 样品液相色谱Fig.10 Sample liquid chromatogram

3 结论

通过对萃取溶剂的考察，提取液中96%的DMY可以经过萃取，转移至乙酸乙酯部位。在静态吸附考察中，对比4种大孔吸附树脂，HPD-100树脂对DMY的吸附和解吸效果均高于其他树脂。其对DMY的吸附量最高可达到14.1 mg/g，解吸率可达到87%以上。在动态吸附考察中，30%乙醇溶液做洗脱剂，3.5 BV可洗脱下95%以上的DMY，浓缩干燥后，纯度达到95.4%以上。此方法试验工艺条件简单，不需要同时串联多个色谱柱，不需要采取多次水重结晶或其他方法即可获得较高纯度的DMY。同时，采用30%浓度乙醇洗脱使成本降低，安全性增高，适合工业化生产。