毛菊苣中活性物质体外抗肿瘤活性筛选的实验研究

叶银松,雷 毅，马晓丽,2，康金森,2，陈锦锦，杨 建,2

(1新疆医科大学药学院，乌鲁木齐 830011；2新疆天然药物活性组分与释药技术重点实验室，乌鲁木齐 830000)

毛菊苣（Cichorum glandulosumBoiss.et Huet)为菊科菊苣属植物，主要生长于我国新疆，所含的倍半萜内酯类成分是该植物的特征成分，主要存在于毛菊苣的根、茎、种子中，具有很高的药用价值[1-4]。在医学上毛菊苣常被用作胆碱药和利尿剂，以改善肝功能，同时在抗肿瘤方面显示了良好的疗效，存在多成分多靶点起效的特点[5-9]。肿瘤以对机体的危害性程度和细胞的特性，将其分为良性肿瘤和恶性肿瘤，恶性肿瘤包括癌和肉瘤，其中源于上皮组织的恶性肿瘤即为癌。研究表明，乳腺癌的发病率在2020 年全球恶性肿瘤新发病例中居于首位，是女性最致命的恶性肿瘤之一，占女性诊断癌症的22%[10]。近年来，尽管在针对乳腺癌的治疗策略上取得了重大进展，但在女性群体中仍是癌症相关死亡的第二大因素。根据GLOBOCAN 2020 年癌症发病率及死亡率的估计值,乳腺癌新增病例230 万，占癌症新增病例的11.7%[11-15]。目前针对乳腺癌治疗的化疗、药物靶向治疗等，取得了一定的治愈和缓解效果，但多数患者在不同程度上存在对化疗药物的耐药及不良反应。本研究以多种肿瘤细胞为模型，筛查毛菊苣的抗肿瘤活性，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器HF 240 型CO2孵箱（上海力申公司）；KS 18 型超净台（美国Thermo 公司）；CKX41 型倒置显微镜（日本OLYMPUS 公司）；Spectra Max® M5 型酶标仪（美国MD 公司）；88500V 型-80℃超低冰箱（美国Thermo 公司）；YDS-80-200F 型液氮冻存罐（中国东亚机电公司）；Fresco 17 型低温离心机（美国Thermo公司）；DK-80 型恒温水浴箱（上海一恒科技公司）；BCD-539WT 型普通冰箱（海尔公司）；Milli-QA10Ac⁃ademic 型纯水仪（美国Millipore 公司）；MLS-3750 型压力蒸汽灭菌器（日本SANYO公司）。

1.2 试药毛菊苣药材购买于新疆和田地区墨玉县，经新疆医科大学药学院天药教研室胡君萍教授鉴定为菊科菊苣属植物毛菊苣的全草。山莴苣素、山莴苣苦素、菊苣酸和绿原酸单体化合物由中国科学院新疆理化技术研究所提供。顺铂（Cisplatin，美国Med Chem Express 公司）；Cell Titer-Glo 化学发光细胞活性检测试剂盒（美国Promega 公司）；胎牛血清（以色列BI 公司）；DMEM 培养基（美国Gibco 公司）；双抗（美国Sigma公司）；胰酶、100 mm细胞培养皿（美国Hyclone公司）；96 孔细胞培养板、细胞无菌冻存管、15 mL 离心管（美国Corning 公司）；0.22 μm 无菌滤器（美国Millipore 公司）；移液枪（美国Ep⁃pendorf 公司）。

1.3 细胞株NCI-H358 人非小细胞肺癌细胞株、BXPC-3 人原位胰腺癌细胞株、NCI-N87 人胃癌细胞株、COLO-205 人结肠癌细胞株、MDA-MB-453 人乳腺癌细胞株、MDA-MB-468 人乳腺癌细胞株、SKBR-3 人乳腺癌细胞株、HCC1954 人乳腺导管癌细胞株均购买于美国ATCC细胞库公司。

1.4 方法

1.4.1 受试单体化合物母液配制 取山莴苣素、山莴苣苦素、菊苣酸和绿原酸单体化合物溶解于DMSO，配制成浓度为50 μmol/L的母液，备用。

1.4.2 细胞株的培养 取NCI-H358 人非小细胞肺癌细胞、BXPC-3 人原位胰腺癌细胞、NCI-N87 人胃癌细胞、COLO-205 人结肠癌细胞、MDA-MB-453 人乳腺癌细胞、MDA-MB-468人乳腺癌细胞、SK-BR-3人乳腺癌细胞、HCC1954 人乳腺导管癌细胞，按常规贴壁细胞培养法接种于含体积分数10%胎牛血清的DMEM 培养基中，在温度为37℃、5%CO2、饱和湿度的条件下常规培养。

1.4.3 细胞活力的检测 将细胞以5×104个/mL 的密度，接种于96 孔板（100 μL/孔），待细胞完全贴壁且生长状态良好，将培养的细胞加入含药培养基100 μL 混匀，进行细胞实验时分别用培养基按照3.16 倍稀释成9 份，同时设置正常细胞对照组，标注好给药时间和浓度，放入37℃，5%CO2细胞培养箱中孵育至给药终点。按照CellTiter-Glo 化学发光细胞活性检测试剂盒的操作手册进行，各组细胞用胰酶消化后使细胞悬浮在培养基中，并进行细胞计数，然后在96孔板的每孔中加入100 μL 细胞悬液，细胞浓度从50 000 个/孔稀释到24 个/孔。空白孔中加入不含细胞的培养基，用于检测背景光值。每孔中加入100 μL CellTiter-Glo 试剂，将微孔板放在振荡器上温和振荡混匀2 min，室温孵育10 min，使其产生稳定的发光信号，用SpectraMax® M5 酶标仪进行读数，采用GraphPad Prism8.0 软件通过非线性S 曲线回归拟合数据得出剂量-效应曲线,并计算IC50值。细胞存活率%=（Lum 待测药-Lum 培养液对照）/(Lum 细胞对照-Lum培养液对照)×100%。

1.4.4 有效单体化合物初筛 采用不同浓度的山莴苣素、山莴苣苦素、菊苣酸和绿原酸分别处理NCIH358 人非小细胞肺癌细胞和MDA-MB-453 人乳腺癌细胞细胞72 h 后，采用CTG 化学发光法测定NCIH358 人非小细胞肺癌细胞和MDA-MB-453 人乳腺癌细胞的IC50。

1.4.5 有效单体化合物复筛 将初筛对肿瘤细胞活力surviving cells 大于50%的单体化合物舍去，此单体化合物对癌细胞活力无明显影响，用不同浓度单体化合物分别处理BXPC-3 人原位胰腺癌肿瘤细胞、NCI-N87 人胃癌细胞、COLO-205 人结肠癌细胞、MDA-MB-468 人乳腺癌细胞、SK-BR-3 人乳腺癌细胞和HCC1954 人乳腺导管癌细胞72 h 后，采用CTG化学发光法测试细胞的IC50。

2 结果

2.1 毛菊苣中单体化合物初筛菊苣酸和绿原酸对NCI-H358 人非小细胞肺癌细胞和MDA-MB-453 人乳腺癌细胞活力无明显影响。山莴苣素和山莴苣苦素对NCI-H358 人非小细胞肺癌细胞和MDAMB-453 肿瘤细胞活力随浓度的升高有明显抑制作用。经计算得出，山莴苣素对NCI-H358 肿瘤细胞的IC50为28.3 μmol/L，山莴苣苦素对NCIH358 肿 瘤 细 胞的IC50为5.9 μmol/L；山莴 苣 素对MDA-MB-453 人乳腺癌细胞的IC50为6.237 μmol/L，山莴苣苦素对MDA-MB-453 人乳腺癌细胞的IC50为1.082 μmol/L，Cisplatin 组IC50为15.94 μmol/L。结果提示，山莴苣苦素在体外具有较强的抗肺癌效果；山莴苣素和山莴苣苦素在体外对人乳腺癌细胞活力具有较强的抑制效果且优于阳性对照药Cisplatin,见图1。

图1 毛菊苣中单体化合物抗肿瘤初筛结果

2.2 毛菊苣中单体化合物复筛山莴苣素对BXPC-3肿瘤细胞的IC50为36.1 μmol/L，山莴苣苦素对BXPC-3肿瘤细胞的IC50为8.7 μmol/L；山莴苣素对NCI-N87人胃癌细胞的IC50为14.8 μmol/L，山莴苣苦素对NCI-N87 人胃癌细胞的IC50为5.4 μmol/L；山莴苣素对COLO-205 人结肠癌细胞的IC50为8.3 μmol/L，山莴苣苦素对COLO-205 人结肠癌细胞的IC50为2.9 μmol/L；山莴苣素对MDA-MB-468 人乳腺癌细胞的IC50为5.5 μmol/L，山莴苣苦素对MDA-MB-468 人乳腺癌细胞的IC50为3.3 μmol/L；山莴苣素对SKBR-3 人乳腺癌细胞活力的IC50为10.0 μmol/L，山莴苣苦素对SK-BR-3 人乳腺癌细胞活力的IC50为1.5 μmol/L；山莴苣素对HCC1954 人乳腺导管癌细胞活力的IC50为12.8 μmol/L；山莴苣苦素对HCC1954 人乳腺导管癌细胞活力的IC50为5.6 μmol/L，见表1、图2。

图2 毛菊苣中单体化合物抗肿瘤复筛结果

表1 毛菊苣中山莴苣素和山莴苣苦素抗肿瘤活性比较

3 讨论

本实验研究采用CellTiter-Glo 发光法，CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay 是 基 于ATP 检 测的快速细胞活力检测法[16]。在国内外被广泛应用，是公认的高灵敏度发光检测法，细胞活力检测的金标准[17-20]。基于常见的人非小细胞肺癌细胞NCIH358、人原位胰腺癌细胞BXPC-3、人胃癌细胞NCIN87，人结肠癌细胞COLO-205、人乳腺癌细胞MDAMB-453、MDA-MB-468、SK-BR-3、人乳腺导管癌细胞HCC1954 这8 种肿瘤细胞，考察毛菊苣中山莴苣素、山莴苣苦素、菊苣酸和绿原酸的抗肿瘤活性，结果发现毛菊苣的提取物山莴苣素和山莴苣苦素具有较强的抑制肿瘤细胞增殖作用，其中对乳腺癌和结肠癌细胞的抑制作用较强，特别是山莴苣苦素对乳腺癌细胞增殖具有更强的抑制作用。