Cajal间质细胞自噬参与儿童原发性肾盂输尿管连接部狭窄发病及机制研究

李 凯，叶尔登，阿布都赛米·阿布都热衣木，叶尔番，王 俊，李水学

(新疆维吾尔自治区儿童医院泌尿外科,乌鲁木齐 830000)

先天性肾盂输尿管连接部狭窄（ureteropelvic junction obstruction，UPJO）是指尿液自肾脏分泌产生流入输尿管时产生的部分性狭窄，可通过产前超声发现，其发病率为0.2%[1]。随着产前超声的进步，UPJO 的产前检出率得以提高。目前认为，UPJO 主要是由于患者胚胎发育时期肾盂输尿管连接部狭窄引起尿液引流不畅导致大量的尿液潴留，进一步使肾盏扩张和肾盂内压力增高，最终压迫肾实质造成肾实质变薄和肾功能损伤[2]。尽管过去几十年来对UPJO 从胚胎学、解剖学、形态学以及病理学等方面进行了大量研究，特别是其病因研究取得了一定进展，但其确切病因及治疗原则与方法仍存在争议[3]。

在输尿管组织内存有多种类型的神经网络，而这些神经组织可能与肾盂输尿管的蠕动功能存在密切关[4]，UPJO 的肾盂输尿管连接部Cajal间质细胞（in⁃terstitial cells of Cajal，ICC）明显减少，可能为本病发病原因[5-6]。ICC 与神经传导支配有关，它是慢波电位的起搏者和基本电节律的传播者。输尿管中的ICC研究表明，与胃肠道蠕动受ICC 控制一样，输尿管蠕动也与ICC 有关，并发现ICC 也分布于输尿管的全长[7]。ICC 与平滑肌细胞之间、神经细胞之间可形成网络连接，此种网络结构的特点在其控制平滑肌的蠕动和介导神经信息传导的功能中有重要作用[8]。在对UPJO 病因的进一步研究中发现，ICC 参与神经信号传导并调控输尿管肌层蠕动，其密度降低可能与UPJO 可导致尿液引流受阻有关[9]。自噬是细胞内一种重要的生物学过程，细胞内自噬的平衡对细胞正常生理功能的维持至关重要[10]。ICC 在UPJO 减少的机制和原因目前仍不清楚。本研究以ICC 在UPJO表型变化切入点，分析其参与输尿管蠕动及自噬的机制，得出ICC 自噬在UPJO 中的发病作用及关系，为其今后的防治提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象随机选择新疆维吾尔自治区儿童医院2020年1月－2021年1月初诊为UPJO且入院行肾盂输尿管成形术患者20 名，术中收取并保存肾盂输尿管连接部组织标本，建立UPJO 标本库。同期选择年龄性别匹配，因肾脏肿瘤行肾切除肾盂输尿管连接部组织的患者15例（排除肾盂输尿管连接部狭窄，肿瘤患者组织学证实无侵犯）。建立UPJO 及对照组患者数据资料库，记录所有患者的临床病历资料，包括病理结果、影像学结果、化验检查结果等。研究得到新疆医科大学医院伦理委员会的批准，并获得了所有参与者的书面知情同意。

1.2 纳入和排除标准纳入标准：最终术中证实为UPJO 组为肾盂输尿管连接部狭窄，病理结果证实对照组肿瘤未侵犯肾盂输尿管连接部；年龄在18 岁以下患者且配合治疗，患者及家属知情同意入组本临床研究；无其他明显基础疾病影响患者生存健康状况；无其它并发泌尿系畸形患者；患者为有效临床随访者。排除标准：病理结果证实肿瘤侵犯肾盂输尿管连接部；临床失联、失访者；患者及其家长无法配合临床检查及治疗者；家长拒绝入组研究者；同时存在其他部位肿瘤或严重疾病者；患者住院临床资料缺失者。

1.3 取材及免疫组织化学手术沿纵行方向切取患者的肾盂输尿管连接部组织，用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切成4 μm 厚的切片。然后，切片在二甲苯中脱蜡，用梯度乙醇重新水化，室温干燥48 h 后置入4℃冰箱内保存，用酪氨酸激酶受体（tyrosine ki⁃nase receptor，c-kit）免疫组化染色，染色步骤均按试剂盒说明操作。抗体按1:100 稀释。c-kit 免疫组化染色UPJO 30 例，对照组20 例，细胞胞浆内可见棕色颗粒状物质者即为c-kit阳性细胞。

1.4 Masson染色石蜡切片脱蜡水化后，用Harris’s苏木素染核10 min，水洗1 min，入Masson复合染色液染色10~20 min。以0.2% 醋酸水溶液速洗1~2 s。5.1%磷钼酸处理5~8 min，不用水洗1%亮绿SF 染色2~4 min。快速用新鲜95%无水酒精分化兼脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

1.5 实时荧光定量核酸扩增检测（qPCR）自噬相关基因变化使用TRIZOL 试剂从组织中提取总RNA，并使用光密度（260 nm和280 nm）测量RNA纯度和浓度。然后，根据说明书，通过RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit 将RNA 逆转录为cDNA。在ABI 7500 序列检测系统中使用QuantiNova SYBR Green PCR 进行反应。所使用的的引物由上海生工公司Primer Premier 5.0 软件设计、合成，以管家基因AC⁃TIN 为内参，引物序列见表1。反应条件为：95℃初始热活化5 min 后，95℃变性10 s，60℃退火20 s，70℃延伸40 个循环。采用2-△△CT法分析目的基因在不同组间的表达差异。

表1 引物序列信息

1.6 免疫印迹法（Western blot）检测在含有蛋白酶抑制剂的RIPA 缓冲液中裂解组织，BCA 试剂盒测定蛋白质浓度。取等量的总蛋白质在SDS-PAGE 上分离并转移到PVDF 膜上。用5%脱脂牛奶封闭后，将膜与以下一抗在4℃下孵育过夜：P62 (1:1 000)、LC3I(1:1 000)、LC3II(1:500) 和β-actin(1:2 000)。用PBS 洗涤3 次，将膜与适当的二抗一起孵育。使用Image J 对蛋白质进行定量，并使用β-actin 进行标准化。

1.7 组织免疫荧光检测切片用柠檬酸缓冲液处理并加入山羊血清以阻断非特异性背景染色。将切片与包括LC3B(1:100)和c-kit(1:50)在内的一抗在4°C下孵育1 h。之后，切片用PBS 洗涤3 次并与二抗FITC（山羊抗小鼠，1:200）和TRITC (山羊抗兔，1:100)在37°C 下在黑暗中孵育90 min。切片再次用PBS 洗 涤，加 入600 μL 的Hoechst33258 染 液，室温避光孵育10 min。洗涤完毕将玻片滴加抗荧光猝灭液封片，置于荧光显微镜下观察，并拍照保存。

2 结果

2.1 UPJO 患者ICC 数量及形态学观察c-kit 染色结果表明，与对照组相比，ICC 在UPJO 连接部明显减少（图1A、1B）。Masson 染色显示，与对照组相比，UPJO 连接部肌纤维明显减少，胶原纤维增多（图1C、1D）。对ICC核肌纤维数量进行统计，汇总分析显示，与对照组相比，UPJO 患者的UPJ 处的ICC 和肌纤维密度均显著降低，而胶原纤维的密度则显著增加（P<0.01）。

图1 UPJO患者ICC数量及形态学观察

2.2 UPJO 患者中c-kit 和自噬相关蛋白LC3 的表达与对照组相比，UPJO 组c-kit 表达下降，c-kit 阳性的细胞中LC3表达升高（图2）。

图2 UPJO患者中c-kit和自噬相关蛋白LC3的表达

2.3 UPJO 患者ICC 和自噬小体变化在对照组中，ICC 呈纺锤形，细胞核较大，细胞质较少（图3A）。自噬小体很少（图3B）。然而，UPJO 患者中观察到ICC超微结构的改变，以及细胞器变性或减少，甚至是空泡化(图3C)。同时在UPJO 患者中观察到ICC 自噬泡形成，ICC与周围细胞之间的缝隙连接较少（图3D）。

图3 电镜观察UPJO患者中ICC和自噬小体变化（×20 000）

2.4 UPJO 患者中自噬相关基因变化qPCR 检测自噬相关基因P62和LC3结果表明，与对照组相比，UP⁃JO组P62基因表达显著降低（P<0.05），LC3基因表达升高（P<0.05），见图4。

图4 P62和LC3基因在UPJO患者中表达情况

2.5 UPJO 患者中自噬相关蛋白表达变化Western blot 法检测组织中自噬相关蛋白P62 和LC3II/LC3I 的表达水平变化的结果显示，与对照组相比，UPJO 组P62 蛋 白表达降 低，LC3II/LC3I 表达升高。见图5。

图5 P62、LC3I和LC3II蛋白在UPJO患者中表达

3 讨论

UPJO 发病机制尚不明确，现在主要认为是由于胚胎发育时输尿管近端发育异常引起[11]。胚胎第12周时，输尿管口及中肾等完成了演变，形成最后位置。如果此时肾盂输尿管连接部再通过程出现异常，如管化不完全，则会出现梗阻，可能是先天性肾盂输尿管连接部狭窄引起肾积水的重要原因[12]。输尿管ICC 中进行的研究证实，与胃肠道蠕动受ICC 控制一样，输尿管蠕动也与ICC 有关，且ICC 也分布于输尿管的全长。本研究结果证实了ICC 在UPJO 连接部明显减少，输尿管固有层的病理生理变化是导致UPJO 的直接原因。Senol 等[13]发现UPJO 患者固有层的肌纤维减少，胶原纤维增多，考虑可能为梗阻原因，与本研究结果一致。输尿管在胚胎发育期间由于近端缺血造成发育不良也会导致UPJO 发生[14]。UPJ 部ICC 密度降低与UPJO 发病有关，病理学检查结果也证实正常儿童输尿管连接处ICC 与内层纵行肌纤维平行，并与神经元关系密切，这提示ICC 参与神经信号传导并调控输尿管肌层蠕动[15]。

细胞内自噬的平衡对细胞正常生理功能的维持至关重要。一旦自噬的平衡遭到破坏就会引发多种疾病，如糖尿病、癌症、神经系统疾病的发生[16]。细胞正常生理状态下自噬的活性比较低，一旦自噬被诱导后，参与自噬起始的相关蛋白会在一个特殊的部位组装，形成自噬小体的前体[17]。具有明显家族史的UPJO 患者可表现出常染色体显性或隐性遗传，符合单基因遗传病的特征，可能与单个基因的突变有关[18]。通过UPJO 家系研究发现TBX18 基因突变与UPJO 发病关系密切[19]。自噬主要帮助机体适应代谢应激,在细胞减少和程序性细胞死亡的开始时变得过度。作为一种独特的膜运输形式，自噬过程中自噬体吞噬细胞器和细胞溶质大分子，并将其输送到溶酶体进行降解[20]。LC3 是哺乳动物细胞中醇母ATG8基因的同源物,能靶向定位于自噬体膜,参与自噬的形成,LC3 分为I 型和于型,I 型常规表达、游离存在于胞质中。当自体吞噬发生时,I 型LC3 经泛素样加工修饰过程与自噬膜表面的磷脂酰乙醇胺结合,形成II型LC3,II 型LC3 蛋白结合并始终位于胞内自噬体的膜上,其含量与自唯泡数量成正比。自噬通过LC3 链接胞浆内的P62 将散乱蛋白DVL2 募集到自噬体内进行降解[21]。本研究观察到ICC 自噬泡形成，ICC 与周围细胞之间的缝隙连接较少，同时发现P62蛋白表达降低，LC3II/LC3I 表达升高。本研究证明了ICC 自噬及缝隙连接蛋白的异常表达参与UPJO 疾病的进程，为UPJO患儿中ICC减少的机制研究奠定了基础。