基于免疫性PTR的HPA基因交互作用研究

梁 静，范 娜，王 瑶，刘 雯，居 敏，叶海燕

(新疆医科大学第六附属医院1 检验科,2 输血科,乌鲁木齐 830002；3新疆医科大学第一附属医院输血科,乌鲁木齐 830011；4 新疆喀什地区第一人民医院输血科,新疆喀什 844000）

血小板输注无效（platelet transfusion refractori⁃ness，PTR）发生率高达30%~70%[1-2]，是治疗出血性疾病过程中常见的难治性临床问题[3-4]。非免疫因素引起的PTR 去除病因、对症处理后可以明显改善血小板的输注疗效，而免疫性PTR 机制复杂，是发生难治性PTR 的重要原因[5]。目前认为血小板特异性抗原（human platelet antigens，HPA）基因多态性及抗体阳性率与免疫性PTR 的产生密切相关，HPA 抗体引起的PTR 占免疫因素的10%~20%[6-8]，常见报道中多以单位点HPA 对PTR 的产生进行分析，如中国人群中HPA-3、HPA-15 系统不配合率最高，欧美国家多由HPA-1a、HPA-5b、HPA-2b 抗体引起PTR 多见[9]。但单位点对复杂疾病的影响（主效应）非常微弱，不能全面揭示两者的关联。随着分子生物学技术的不断进步，各种疾病中基因交互作用被相继报道，但有关引起免疫性PTR 的HPA 基因间交互作用的研究尚缺乏[10]。本研究拟建立免疫性PTR 的HPA 基因交互作用预测模型，深入认识免疫性PTR 的发病机制,探索HPA 基因交互作用在免疫性PTR 风险分析中的作用，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象收集2019 年6 月－2020 年6 月新疆喀什地区第一人民医院、新疆医科大学第六附属医院及新疆医科大学第一附属医院免疫性PTR 患者190 例作为病例组，纳入标准:（1）输注前血小板≤50×109/L；（2）血小板输注无效（血小板回收率PPR）和输注后血小板校正增加指数（CCI），CCI 判断血小板输注无效的标准为血小板输注1 h 后的CCI<7 500 或输注后24 h后的PPR<4 500；（3）血小板输注量小于3个治疗量，输注次数低于3次；患者均签署知情同意书。排除标准：（1）抗-HIV 阳性；（2）DIC；（3）败血症；（4）脾功能亢进；（5）活动性出血；（6）血容量不足需液体复苏；（7）输注其他血液制品；（8）住院期间服用两性霉素B、万古霉素和免疫球蛋白；（9）不能配合完成本研究；同期收集50 例血小板输注有效的患者作为对照组。本研究获医院伦理委员会审核批准。

1.2 试剂与仪器人类血小板同种抗原HPA1-17 基因分型试剂盒（天津秀鹏），ABI9902PCR 扩增仪（Thermo 公司）；2500 型凝胶成像系统（上海天能公司）；BG-Power600i 常规电泳仪（北京百晶公司）。

1.3 HPA 基因分型满足质控要求的标本严格按照人类血小板同种抗原HPA1-17（PCR-SSP 法）、Cab基因分型试剂盒说明书上操作进行操作。

1.4 统计学分析采用多因子降维分析方法（gener⁃alized multifactor dimensionality reduction,GMDR）0.7软件对HPA 系统基因分型交互作用建模进行分析。根据统计分析结果的训练平衡准确度、测试平衡准确度、符号检验P值及交叉验证一致性等参数评估HPA 基因分型交互作用在输注血小板患者中发生PTR 的风险。HPA 系统基因-基因交互作用模型图每个方格代表一种基因-基因的交互组合，方格颜色的深浅与该基因-基因组合对疾病的风险性呈正相关。方格颜色越深，表示该组合发生PTR 风险越高。每个方格中，左边条带是组合的正向得分，右边条带是组合的负向得分，正向得分越高，表明该组合发生PTR风险也越高。

2 结果

2.1 HPA 基因 分型HPA1~6，15 共7 个基 因位点频率分布结果显示：仅HPA-3 位点等位基因频率分布在病例组与对照组差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

表1 HPA基因位点不同等位基因在对照组和病例组中的分布

2.2 GMDR分析HPA基因系统分型交互作用模型

2.2.1 HPA不同分型交互作用模型 HPA基因分型1阶-9 阶交互作用模型中第3 阶（HPA-3,5,15）模型测试准确度最大（testing accuracy:0.625）,交叉验证一致性最好（CVC=8/10），该组合提供了最高验证样本准确度与最佳交叉验证一致性，且有统计学意义(P=0.001) ，为最佳模型。模型第4 阶（HPA-2,3,5,15）及第5 阶（HPA-2,3,5,6,15）模型次之，P<0.05。表明第3、4、5阶在对照组和病例组间差异有统计学意义（P<0.05），第1、2、6、7、8、9 阶模型准确度大，但是交叉验证一致性较差，差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表2 HPA不同分型交互作用模型

2.2.2 HPA系统基因-基因交互作用模型图（1）3阶[HPA-3 HPA-5 HPA-15]三因子交互作用模型图。PTR 患者携带HPA-3aa、HPA-5aa、HPA-15ab，该组合的方块颜色最深，正向得分最高为5.2，该组合发生PTR 风险高，见图1。（2）4 阶[HPA-2 HPA-3 HPA-5 HPA-15]四因子交互作用模型图。PTR 患者携带HPA-3aa、HPA-5aa、HPA-15ab、HPA-2aa 的组合方块颜色最深，正向得分最高为5.2，该组合发生PTR风险高，见图2。（3）5 阶[HPA-2 HPA-3 HPA-5 HAP-6 HPA-15]五因子交互作用模型图。PTR 患者携带HPA-3aa 基因型、HPA-5aa 基因型、HPA-15ab 基因型、HPA-2aa 基因型及HPA-6 aa，该组合的方块颜色最深，正向得分最高为5.2，该组合发生PTR 风险高，见图3。

图1 HPA-3 HPA-5 HPA-15三因子交互作用模型图

图2 HPA-2 HPA-3 HPA-5 HPA-15四因子交互作用模型图

图3 HPA-2 HPA-3 HPA-5 HAP-6 HPA-15五因子交互作用模型图

3 讨论

血小板输注是治疗因血小板减少引起的出血性疾病的有效治疗措施，但并不是所有患者输入血小板后都能达到预期的治疗效果，其中一个重要的原因是患者在多次输血后机体可产生HPA 抗体、HLAⅠ类抗体、血小板膜糖蛋白GPⅣ（CD36）等血小板抗体，导致血小板输注无效（PTR）[11-12]。如何预防和避免免疫性PTR发生是目前临床上输注血小板治疗的难题。

HPA 作为血小板糖蛋白携带的一类特异性抗原，具有单核苷酸多态性，因此HPA 也呈多态性分布，目前研究多支持PTR 与HPA 等位基因的多态性有关[13]，研究表明PTR 患者HPA-2、HPA-3、HPA-15呈明显的多态性分布，HPA-3、HPA-15 的杂合度最高[14-15]。赵凤春等[16]研究显示HPA-3 基因多态性与PTR患者有显著相关性，为导致PTR的影响因素。但目前大多关于免疫性PTR 的研究忽略了HPA 基因-基因交互作用对PTR 产生的影响。研究表明在复杂性疾病的病因研究中易感基因单核苷酸位点的关联分析发挥着重要作用[17-18]，并且复杂性疾病的发病风险由多个基因共同承担，而基因-基因交互作用已经被认为是复杂性疾病基本的遗传学模式之一[19-20]。

本研究对研究对象进行HPA1-17 基因检测，结果显示：病例组和对照组人群的HPA 基因型频率数据符合Hardy-Weinberg 遗传平衡，均未发生偏离（P>0.05），其中HPA7a-14a、16a、17a 呈单态性，未检出相应HPA-b 等位基因或b 基因频率极低；研究发现HPA-3a 基因位点与发生免疫性PTR 具有关联性，且携带HPA-5a 等位基因的个体可能更容易罹患PTR。进一步通过GMDR 分析建立HPA 不同分型交互作用模型，探究HPA 基因交互作用与免疫性PTR 的关联性，结果显示：九阶HPA基因交互作用模型中，第1阶（HPA-3）、2 阶（HPA-3,15）、6 阶（HPA-1,2,3,5,6,15）、7 阶（HPA-1,2,3,4 ,5,6,15）、8 阶（HPA-1,2,3,4,5,6,15,7）、9 阶（HPA-1,2,3 ,4 ,5 ,6 ,15,7,8）模型测试准确度及交叉一致性显示对免疫性PTR 风险预测无统计学意义，而第3 阶（HPA-3,5,15）、4 阶（HPA-2,3,5,15）、5阶（HPA-2,3,5,6,15）存在交互作用且与PTR 发生密切相关，其中第3 阶（HPA-3,5,15）模型测试准确度最大0.625，为血小板输注患者中评估免疫性PTR 发生风险的最佳模型。第1、2、6、7、8、9 阶HPA 基因交互模型差异无统计学意义，故不作继续研究，仅对第3、4、5 阶HPA 基因交互模型进行进一步研究。通过HPA 基因系统模型图显示，第3阶模型PTR 患者携带HPA-3aa、HPA-5aa、HPA-15ab，发生PTR 风险高，第5阶模型在第3阶模型基础上携带HPA-2 aa或HPA-6aa 基因，对免疫性PTR 的发生有重要推进作用，HPA-2 aa、HPA-6aa 基因可能协同增强了免疫性PTR发生的风险。

本研究是对免疫性PTR 患者基因-基因交互作用模型构建及风险预测的有益尝试，为深入了解免疫性PTR 的发生机制及临床预防提供了实验依据和参考。利用HPA 基因交互作用模型提前对免疫性PTR进行风险分析及预判，筛选合适的血小板制品进行配型，尽量避免PTR发生。