血清miR-1225-5p在骨肉瘤病人诊断及预后中的价值

李 伟，汪礼军，唐 鹏，黄耀凯，刘 剑

骨肉瘤是临床上常见的原发性恶性骨肿瘤，多发于儿童和青少年，年发病率为百万分之三[1]。骨肉瘤病人的5年生存率为60%～70%，当发生远处转移时可降至20%～30%[2]。尽管在过去几十年里，骨肉瘤的治疗取得了很大的进展，如广泛肿瘤切除术、新辅助放化疗等，但是病人5年生存率和无病生存率仍然较低[3]。因此寻找新的诊断及预后标志物势在必行。微小RNA(miRNAs)是一类高度保守的非编码RNA，其长度为19～25个核苷酸。miRNAs可与靶mRNA的3′-UTR互补结合，抑制基因转录。miRNAs在人类多种肿瘤中有异常表达，并参与细胞增殖、分化、迁移和凋亡等生理学过程，发挥促癌或抑癌作用[4]。miR-1225-5p在骨肉瘤组织和细胞系中的表达明显下调。miR-1225-5p可通过靶向SOX9基因抑制骨肉瘤细胞的增殖和侵袭，提示miR-1225-5p在骨肉瘤中起到抑癌作用[5]。既往研究发现，miR-1225-5p在甲状腺癌[6]、胰腺癌[7]和喉癌[8]等癌症中同样起到抑癌作用。血清miR-1225-5p对骨肉瘤病人诊断及预后的评估有何意义，既往少有报道。本研究采用RT-PCR检测了104例骨肉瘤病人血清中miR-1225-5p的表达水平，旨在探讨血清miR-1225-5p在骨肉瘤诊断及预后中的价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2013年6月至2017年6月 本院收治的104例骨肉瘤病人(骨肉瘤组)、45例 骨膜炎病人(骨膜炎组)和50名健康体检者(对照组)为研究对象。骨肉瘤组纳入标准：(1)病理组织学检查确诊为骨肉瘤；(2)术前未接受放化疗或免疫治疗；(3)临床资料完整。排除标准：(1)资料不全；(2)失访；(3)合并其他肿瘤疾病。3组性别和年龄均具有可比性。骨肉瘤病人于术前及术后3个月时采血，骨膜炎病人于诊断当日采血，对照组于体检当日采血。采集骨肉瘤病人如下资料：性别、年龄、肿瘤部位、Enneking分期、病理分级、肿瘤直径、远处转移等。对骨肉瘤病人随访24～61个月，总生存期(overall survival，OS)定义为诊断当日至末次随访或死亡。无病生存期(disease-free survival，DFS)定义为自随访之日起，疾病复发或由于疾病进展导致病人死亡的时间[9]。本实验已经过伦理委员会批准，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 RT-PCR检测血清miR-1225-5p表达水平 将外周血在 4 ℃、2 000 r/min条件下离心15 min，获得血清。用miRcute miRNA分离试剂盒(上海康朗生物科技有限公司)提取总RNA。用紫外分光光度计(上海豫明仪器有限责任公司)检测RNA浓度和纯度。用TaqMan miRNA反转录试剂盒(北京百奥莱博科技有限公司)进行反转录和RT-PCR，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。本研究引物均由苏州泓迅生物科技股份有限公司设计并提供。miR-1225-5p引物：上游：5′-AGA TCG CCG TGT AAG CTA GCC TTG CGT GGA GAG CTG TAC-3′；下游：5′-GGG AGA GGG GCT TAG CTA GCA TCC GGG GAT ACC TTG GAG-3′。内参U6 RNA引物：5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′；下游：5′-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3′。采用2-△△Ct法计算miR-1225-5p相对表达量[10]。以中位数为截断值，将骨肉瘤病人分为高表达组和低表达组。

1.3 统计学方法 采用单因素方差分析、LSD-t检验、χ2检验；绘制ROC曲线分析miR-1225-5p诊断骨肉瘤的价值；Kaplan-Meier分析和Log-Rank检验分析生存情况；采用COX比例风险回归模型分析影响病人预后的因素。

2 结果

2.1 骨肉瘤病人血清miR-1225-5p表达水平及其与临床特征的关系 miR-1225-5p的扩增曲线平滑，基线期、对数期、平台期明显，扩增效果满意(见图1A)。溶解曲线呈单一峰，溶解温度在80～90 ℃之间，说明无引物二聚体或者其他非特异性扩增片段的产生，实验检测结果的特异度比较高(见图1B)。骨肉瘤组、骨膜炎组和对照组的血清miR-1225-5p相对表达量分别为(0.42±0.08)(0.58±0.11)(0.62±0.09)，组间比较差异有统计学意义(F=102.74，P<0.01)，两两比较发现，骨肉瘤组血清miR-1225-5p相对表达量均低于骨膜炎组和对照组(P<0.01)，骨膜炎组低于对照组(P<0.05)。术后3个月，骨肉瘤病人血清miR-1225-5p相对表达量从术前的(0.42±0.08)升高至(0.59±0.10)，差异有统计学意义(t=13.54，P<0.01)。骨肉瘤病人血清miR-1225-5p表达水平与Enneking分期、肿瘤转移有关(P<0.01和P<0.05)，而与性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤直径和WHO骨肉瘤分类无关(P>0.05)(见表1)。

表1 骨肉瘤病人血清miR-1225-5p表达水平与临床特征的关系

2.2 血清miR-1225-5p诊断骨肉瘤的价值分析 ROC曲线分析结果显示，血清miR-1225-5p诊断骨肉瘤的曲线下面积为0.785(95%CI：0.625～0.934)。当血清miR-1225-5p相对表达量为0.46时约登指数最大，此时灵敏度和特异度分别为89.35%和71.30%(见图2)。

2.3 血清miR-1225-5p与骨肉瘤病人临床预后的关系分析 用Kaplan-Meier分析和Log-Rank检验分析骨肉瘤病人的生存情况，结果显示高表达组OS和DFS均高于低表达组(P<0.05和P<0.01)(见图3、4)。COX多因素分析结果显示，血清miR-1225-5p是影响骨肉瘤病人OS和DFS的独立因素(P<0.05和P<0.01)(见表2)。

表2 COX比例风险回归模型分析影响骨肉瘤病人预后的因素

3 讨论

骨肉瘤是临床上儿童、青少年最常见的恶性骨肿瘤，高发于15～19岁人群。骨肉瘤极易发生局部浸润和远处转移，因此病人死亡率较高[11]。骨肉瘤病人的5年生存率较低，因此亟需寻找新的生物学标志物指导骨肉瘤的诊治。miRNAs在骨肉瘤的诊治中有重要作用[12]。本研究发现，与骨膜炎病人和健康人相比，骨肉瘤病人血清miR-1225-5p表达水平明显降低，手术治疗3个月后表达水平明显升高。另外本研究证实，miR-1225-5p在骨肉瘤的诊断及预后判断中具有重要意义。

miR-1225-5p位于16p13.3染色体上，在甲状腺癌、胰腺癌和喉癌等癌症中起到抑癌作用。WANG等[6]发现，miR-1225-5p可以靶向去乙酰化酶Sirtuin-3基因，通过Wnt/β-catenin通路抑制甲状腺癌细胞的增殖、侵袭、迁移和分化。ZHONG等[7]发现，miR-1225-5p可以通过Janus 激酶 1促进胰腺癌细胞凋亡、抑制增殖。在喉癌的研究中，SUN等[8]发现miR-1225-5p靶向CDC14B抑制癌细胞增殖，并使细胞周期G1/S期阻滞。TOKUHISA等[13]研究发现，miR-1225-5p与胃癌侵袭性有关，血清外泌体对预测胃癌根治性切除术后腹膜复发有重要意义。

miR-1225-5p在骨肉瘤中作用的报道较少，并缺乏体内研究。ZHANG等[5]发现，SOX9是miR-1225-5p的靶基因，沉默miR-1225-5p后骨肉瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力受到抑制。说明miR-1225-5p在骨肉瘤发生和发展中可能发挥重要作用。本研究采用ROC曲线分析了血清miR-1225-5p诊断骨肉瘤的价值，结果显示miR-1225-5p诊断骨肉瘤的曲线下面积为0.785，灵敏度和特异度分别为89.35%和71.30%。我们还发现，血清miR-1225-5p表达水平与Enneking分期、肿瘤转移有关，说明miR-1225-5p与骨肉瘤病情进展有关。

miR-1225-5p与癌症病人预后的关系既往已有报道。ZHENG等[14]发现，胃癌组织中miR-1225-5p表达水平明显下降，miR-1225-5p低表达组病人的总体生存率明显低于高表达组。骨肉瘤病人的生存预后与性别、年龄、Enneking分期、远处转移等因素有关[15-17]。本研究同样发现，Enneking分期、远处转移是影响骨肉瘤病人预后的独立因素。我们发现，miR-1225-5p高表达组骨肉瘤病人的OS和DFS均高于低表达组，这是因为miR-1225-5p抑制了骨肉瘤细胞的侵袭和转移[5]。

本研究的局限性为：(1)样本量相对较小；(2)未进行miR-1225-5p的机制研究，未来需要通过细胞和动物研究进一步明确miR-1225-5p在骨肉瘤中的作用；(3)仅检测了血清中miR-1225-5p的表达水平，未检测癌组织中的表达情况。

综上所述，本研究表明骨肉瘤病人血清中miR-1225-5p表达水平明显低于骨膜炎病人和健康人。接受手术治疗的骨肉瘤病人血清miR-1225-5p水平显著升高。miR-1225-5p在骨肉瘤的诊断中有重要意义。此外，低血清miR-1225-5p表达水平与骨肉瘤病人的不良预后有关。