TWEAK诱导巨噬细胞源性外泌体miRNA抑制膀胱癌转移的研究

郑祖萍,夏先如,周发友,唐晓磊

膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，居我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位。其发病率随年龄增长而增加，且男性膀胱癌发病率为女性的3～4倍[1]。而研究膀胱癌肿瘤浸润和转移的机制可能有助于确定膀胱癌治疗的潜在分子靶点。

肿瘤微环境是影响肿瘤进展和转移的主要因素。巨噬细胞是免疫相关基质细胞中重要的细胞之一，且系沟通天然免疫和适应性免疫的枢纽，在临床和实验研究中已经证实巨噬细胞能够促进肿瘤的发生和发展[2-3]。因此，肿瘤微环境中的巨噬细胞可以作为治疗干预的潜在靶标。

外泌体是肿瘤细胞与巨噬细胞之间相互作用的重要介导者[4]。外泌体是由多种类型细胞产生的微泡，其源自吞多泡体与质膜的融合。当它们释放到细胞外环境中时，外泌体可以与受体细胞结合并转移细胞细胞表面的分子。研究已经报道了多种生物分子，如脂质、蛋白质和核酸(包括mRNA、microRNA和DNA等)都存在于外泌体中，并且能够调节受体细胞的生物活性[5]。

肿瘤坏死因子样弱凋亡诱导因子(tumor necrosis factor-like weak inducer of apoptosis,TWEAK)是TNF超家族成员之一[6]。它是一种多功能细胞因子，能够与其同源受体成纤维细胞生长因子诱导早期反应蛋白14(fibroblast growth factor induces early reactive protein 14,Fn-14)结合，并影响许多类型癌细胞的生物学性质[6]。这表明TWEAK在调节免疫应答中起着重要作用，并且可能调控肿瘤浸润巨噬细胞的抗肿瘤效应[6-7]。

为探讨TWEAK在膀胱癌中的生物学功能，在本研究中，我们利用ATCC 5637膀胱癌细胞系检测源自肿瘤相关组织巨噬细胞(TMs)的外泌体对其发挥调节作用。现作报道。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 人膀胱癌细胞系ATCC 5637和单核细胞系THP-1购自于武汉大学细胞典藏中心(武汉，中国)。细胞在含有10% 胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)(Gibco公司，澳大利亚)和青霉素/链霉素(1∶100，Sigma公司，美国)的RPMI-1640培养基(Cyclone，GE Healthcare，美国)中进行培养，细胞置于5%CO2、37 ℃潮湿温箱中。为了诱导分化成巨噬细胞，用100 ng/mL佛波酯(Phobo ester,PMA)(Sigma公司)处理THP-1细胞(4×105)，并孵育24 h。分化后，用PBS洗涤细胞3次。

1.2 外泌体纯化、表征和分析 使用总外泌体分离试剂(Invitrogen公司，美国)从细胞培养基中提取外泌体。THP-1细胞在不含胎牛血清的培养基中进行培养。24 h后收集细胞培养基，10 000 g离心30 min除去细胞碎片。将总外泌体分离试剂加入到无细胞培养基中，然后在4 ℃条件下孵育16 h。4 ℃条件下10 000 g离心1 h收集外泌体，然后用500 μL PBS重悬，并用Bicinchoninic Acid Assay蛋白测定法(赛默飞公司,美国)进行定量。同时使用透射电子显微镜(Tecnai G2 Spirit,赛默飞公司，美国)捕获外泌体图像；使用马尔文激光粒度仪(M-ZNano ZS,马尔文公司，英国)来测定外泌体的粒径和分布。

1.3 外泌体标记和追踪 使用PKH67绿色荧光细胞标记试剂盒(Sigma公司)标记来自TWEAK刺激的巨噬细胞的上清液中分离的外泌体。标记的外泌体与ATCC 5637细胞共培养24 h，随后洗脱。使用Leica TCS SP5 Ⅱ激光扫描共焦显微镜来观察受体ATCC 5637细胞对标记的外泌体的摄取。

1.4 miRNA微阵列测定 使用miRNA标记试剂和杂交试剂盒(Agilent Technologies公司，美国)及人miRNA微阵列试剂盒(Agilent公司，美国)对未刺激或TWEAK刺激的TMs源性的外泌体进行微阵列检测。每个样本100 ng总RNA先进行磷酸化处理，然后用Cyanine 3-pCp标记。使用Micro Bio-spin柱(Bio-Rad)纯化标记的RNA，随后在58 ℃下与人miRNA微阵列载玻片杂交20 h。后使用洗涤缓冲液洗涤，并使用Agilent微阵列扫描仪扫描。使用安捷伦的特征提取软件获得原始杂交强度，并检测总共1 852个miRNAs。其中TWEAK刺激的巨噬细胞源性的外泌体miRNA显著升高的列出。

1.5 RNA提取及RT-PCR检测miRNA 使用miRNeasy Mini试剂盒(Qiagen公司，美国)来分离和富集外泌体中的RNA，并使用TRIzol法提取外泌体(100 mg/mL)处理24 h后的卵巢癌细胞中的总RNA。用特异性RT引物逆转录成熟的miRNA-17-3p，设计miRNA-17-3p引物,F:5′-TGC GTT GAC GTC ACT CCC G-3′;R:5′-GTG CAG GGT CCG AGG T-3′[8]。人snRNA RNU6B(U6)用于miRNA表达的数据标准化(U6引物,F:5′-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3′,R:5′-ACG CTT CAC GAA TTT GCG T-3′)[8]。使用2-△△CT方法分析数据。

1.6 miRNA转染 人micrOFF antagomiR-17-3p序列(3′-CUA CAA GUG CCU UCA CUG CAG U-5′)antagomiR和micrOFF antagomiR-NC序列(5′-UUU GUA CUA CAC AAA AGU ACU G-3′)阴性对照购自上海生工(上海，中国)。根据厂家说明书，直接将人hsa-miR-7-5p antagomiR或阴性对照以200 nmol/L的浓度转染到THP-1巨噬细胞。

1.7 免疫印迹分析 从巨噬细胞源性外泌体(100 μg/mL)处理的ATCC 5637细胞中分离总蛋白。用于免疫印迹分析的抗体包括：EGFR兔单抗(碧云天公司,中国)，磷酸化(Ser473/Thr308)AKT兔单抗mAb(碧云天公司,中国)，Akt 1/2兔单抗(碧云天公司,中国)，磷酸化p44/42 MAPK(Thr202/Tyr204)兔单抗，p44/42 MAPK兔单抗(Santa Cruz公司,美国)，GAPDH兔单抗(碧云天公司,中国),羊抗兔IgG单抗(Abcam公司,美国)。兔单抗为一抗(1∶5 000稀释)，37 ℃孵育1 h，PBST洗涤3次；羊抗兔IgG单抗为二抗(1∶8 000稀释)，37 ℃孵育1 h，PBST洗涤5次；加入ECL置于仪器中曝光显影。

1.8 Transwell实验 细胞迁移检测：传代培养的 ATCC 5637细胞2×106/mL重悬于无血清RPMI-1640培养基中，铺于Trans-well聚碳酸酯膜嵌套(康宁公司，美国)上层，将TWEAK刺激后的TMs及对照组置于Trans-well下层。37 ℃ 5%CO2培养24 h后，除去残留在膜上表面的细胞，用显微镜放大200倍计数，平均每个视野的细胞数，每组3个重复试验。

1.9 统计学方法 采用t(或t′)检验、方差分析和q检验。

2 结果

2.1 TWEAK刺激的TMs源性的外泌体被ATCC 5637细胞内化 PMA诱导THP-1单核细胞24 h后，圆形浮动的THP-1细胞变成了贴壁的扁平细胞(见图1A)。巨噬细胞的两个公认的标志物，CD36和CD71的表达显著性增加(见图1B)；行马尔文纳米颗粒分析仪观察，其外泌体直径主要分布在92 nm左右(见图2A和图2B)。且激光共聚焦显微镜观察，其能够被ATCC 5637细胞内化(见图3)。

2.2 TWEAK诱导TMs产生的外泌体中miRNAs的检测 经miRNAs芯片检测，TWEAK处理TMs产生的外泌体中差异表达1 852种miRNAs，其中9种显著高表达miRNAs被罗列(见表1)；在获得TWEAK处理TMs产生的外泌体、GW4869预处理的TMs以及接受外泌体的受体细胞ATCC5637中，发现TWEAK处理后TMs及外泌体中miRNA-17-3P水平均高于未处理组，差异均有统计学意义(P<0.05～P<0.01)；而受体细胞同样在接受TWEAK处理组的外泌体后，miRNA-17-3P水平均高于未处理组，差异均有统计学意义(P<0.01)(见表2)。

表1 TWEAK诱导TMs产生的外泌体中高表达的部分miRNAs(n=3)

表2 TWEAK诱导前后不同胞体内miRNA-17-3p水平的比较(n=3)

2.3 外泌体促进膀胱癌ATCC 5637细胞的转移 通过Transwells实验验证，细胞数，未处理组高于PBS处理组，PBS处理组高于TWEAK处理组，差异均有统计学意义(P<0.01)，说明TWEAK诱导的TMs能够通过外泌体抑制ATCC5637细胞的转移(见表3)；而GW4869预处理能够抑制TWEAK激发巨噬细胞外泌体的释放；TWEAK预处理后的DMSO组和PBS组比较，2组ATCC5637细胞转移数目差异无统计学意义(P>0.05)(见表4)。

表3 不同处理组巨噬细胞产生的外泌体对ATCC 5637细胞转移的影响

表4 TWEAK诱导的巨噬细胞产生的外泌体对ATCC 5637细胞转移的影响

2.4 通过 MiRNA-17-3p抑制AKT和ERK1/2的磷酸化促进膀胱癌ATCC 5637细胞的转移 本研究分别使用不同处理的巨噬细胞(未处理组、TWEAK处理TMs组、TWEAK处理转染antagomiR-17-3p的TMs组及TWEAK处理转染antagomiR-NC的TMs组)分泌的外泌体与ATCC 5637细胞一起孵育，并且通过qRT-PCR和Transwell实验验证了通过干扰TMs中miRNA-17-3p的表达水平，从而影响受体细胞ATCC 5637中miRNA-17-3p的摄入水平(见表 5)，进而影响ATCC 5637细胞转移(见表 6)；通过Western blotting检测ATCC 5637细胞中EGFR、磷酸化AKT和ERK1/2的表达。结果表明，TWEAK刺激的巨噬细胞源性的外泌体在ATCC 5637细胞中均能抑制EGFR的表达，并抑制AKT和ERK1/2的磷酸化，但不影响总AKT和ERK1/2的表达(见图4)。

表5 不同处理组巨噬细胞外泌体作用于ATCC 5637细胞对其miRNA-17-3p的表达的影响

表6 不同处理组巨噬细胞外泌体作用于ATCC 5637细胞对其转移的影响

3 讨论

TWEAK在免疫反应调节中起重要作用，并调控肿瘤浸润性巨噬细胞的抗肿瘤作用[7,9]，但其机制仍未清楚。本研究表明TMs衍生的外泌体可以通过将外泌体miR-17-3p转移到ATCC 5637细胞中而在体内外抑制膀胱癌的转移。

近年来研究表明，外泌体是肿瘤细胞与周围环境之间相互作用的重要介质之一。肿瘤细胞来源的外泌体能有效地破坏紧密连接和血管内皮屏障的完整性以促进肿瘤转移[10]。肿瘤细胞来源的外泌体可以被递送至巨噬细胞，激活巨噬细胞成为具有SCOS3/STAT3途径参与的肿瘤相关巨噬细胞样表型[11]。然而，关于巨噬细胞源性的外泌体转移到肿瘤细胞对其影响的报道较少。本研究首先通过PMA诱导THP-1细胞转化为巨噬细胞，其表面标记物CD36和CD71的表达显著性增加。且证实了TMs源性外泌体的一种新功能，它能减弱ATCC 5637细胞的迁移。以GW4869消除条件培养基中巨噬细胞源性外泌体会导致TWEAK对ATCC 5637细胞的转移几乎没有影响，表明TWEAK主要通过巨噬细胞源性外泌体转移来减弱ATCC 5637细胞的转移。

miRNAs被证实包含在外泌体中，并可以在细胞之间转移[12]。外泌体miRNA调节基因表达和相对稳定的特性。很多研究已经确定miR-17-3p(肿瘤抑制性miRNA)在许多癌症的迁移、侵袭和生长中起着重要作用，如乳腺癌[13]、前列腺癌[14]和多发性骨髓瘤[15]。膀胱癌细胞表达高水平的EGFR，活化的EGFR在细胞迁移和转移中起重要作用[16-17]。因此，抑制EGFR是治疗癌症的一种潜在方法[18]。在本研究中，我们确定TWEAK增加了巨噬细胞源性外泌体和受体ATCC 5637细胞中miR-17-3p的水平，从而降低EGFR/AKT/ERK1/2途径的活性，并最终抑制膀胱癌细胞的转移。我们还发现，在TMs中转染antagomiR-17-3p降低了分泌的外泌体和受体ATCC 5637细胞中miR-17-3p的水平，并使迁移和侵袭增强，这说明从TMs转移的外泌体可以调节ATCC 5637细胞的转移。我们研究揭示了miR-17-3p通过外泌体介导而抑制ATCC 5637细胞转移的新方法。

综上所述，本研究首次证实了TMs能够通过外泌体将miR-17-3p转移到ATCC 5637细胞，并抑制EGFR/AKT/ERK1/2通路，最终导致体内外肿瘤的转移和侵袭受到抑制。此外，我们初步探索了外泌体miR-17-3p作为体内治疗的靶点。