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外泌体介导的miR-18b-5p调控NEDD9对乳腺癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响

2022-02-28杨清玲

蚌埠医学院学报 2022年2期
关键词:外泌体荧光素酶靶向

杨 硕,杨清玲

乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一[1],近年来综合治疗方法如治疗乳腺癌的围手术期化疗和基因治疗蓬勃发展,乳腺癌的疗效有了很大提高,但是肿瘤转移和侵袭的存在导致病人的生存率依然不高,深入研究促进乳腺癌细胞增殖、迁移和转移的分子机制对病人的诊断和预后具有重要意义。microRNA(miRNA)的异常表达在肿瘤的发生与发展过程中起到重要作用,miRNA是一种非常小的RNA分子,通过直接作用于mRNA的3′-UTR来抑制其表达[2]。miRNA即可作为一种致癌因子也可作为一种抑癌因子[3],可以调控癌细胞的增殖、侵袭、迁移和凋亡等生物学活动[4]。miRNA-18b在结直肠癌[5]、卵巢癌[6]、乳腺癌[7]等肿瘤中异常表达的报道表明,其通过调节关键蛋白的表达,影响肿瘤的增殖与侵袭,但其在乳腺癌中的作用及其基本的分子机制目前尚不完全清楚。

外泌体是一种细胞分泌的直径40~100 nm的微小囊泡,可通过细胞分泌到受体,通过向靶细胞转移各种生物活性分子如膜受体、蛋白质、核酸(mRNA、miRNA及其他非编码RNA)[8]作为信号分子传递给其他细胞,特别是外泌体可以携带参与癌细胞增殖、分化和凋亡的miRNA[9],且外泌体中的特异性miRNA 水平升高与癌症进展有关[10]。如乳腺癌来源外泌体miR-448通过靶向NEAT1促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭[11]。但是,外泌体携带的miR-18b-5p在各类型癌症中的作用鲜见探究。靶基因预测软件发现神经前体细胞表达下调蛋白9(NEDD9)可能是miR-18b-5p的靶基因。已知NEDD9是一种转录因子,在多种类型的癌症如乳腺癌[12]、胶质瘤[13]等中发挥功能,抑制NEDD9表达会促进肿瘤发生[14]。本研究探讨乳腺癌细胞来源外泌体对乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响,进一步验证乳腺癌细胞外泌体中的miRNA-18b-5p通过靶向调控NEDD9对乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭的作用,从而为乳腺癌的治疗及预后提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂 乳腺癌上皮细胞MCF-10A和乳腺癌细胞株SKBR-3购自中国科学院细胞库;胎牛血清和DMEM高糖培养基购自Hlyclone公司;Trizol试剂和Lipofectamine2000购自Invitrogen公司;miR-18b-5p inhibitor、miR-18b-5p mimics 和靶向NEDD9的过表达载体以及PCR所用引物均购自上海GenePharma公司;荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)试剂购自Takara公司;所有引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司合成;荧光素酶试剂盒(Promega,美国);BCA 蛋白含量检测试剂盒和细胞凋亡试剂盒(凯基,中国);无外泌体血清(SBI,美国);一抗CD63、TSG101、NEDD9及二抗购自Affinity公司;CCK8试剂盒购自吉玛公司;Transwell小室购自Corning公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 用紫杉醇诱导SKBR-3细胞耐药性的产生,使SKBR-3细胞处于25 μg/mL的浓度中稳定生长。乳腺癌细胞株接种于含10%胎牛血清的DMEM培养基中,在37℃、5% CO2和95%饱和湿度条件下的培养箱中培养。其乳腺癌细胞生长至细胞融合度达到60%~70%密度时,用无外泌体血清培养基培养,48 h后,收集细胞上清液并储存于-80 ℃直至实验使用。

1.2.2 乳腺癌细胞外泌体的提取、分离及鉴定 正常乳腺癌上皮细胞MCF-10A及乳腺癌细胞用含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM培养基置于37 ℃、5% CO2培养箱中传代培养。待细胞密度达到80%时,更换为无外泌体血清培养基。收集细胞培养上清液于室温2 000 g 4 ℃离心30 min;收集上清液继续在10 000 g 4 ℃ 离心30 min;最后得到上清液再100 000 g 4 ℃离心70 min。将沉淀重悬于1×PBS中,使用0.22 μm 孔径过滤器过滤。继续100 000 g 4 ℃离心70 min。弃去上清液,1×PBS重悬,放入-80℃冰箱保存备用。采用Western blotting检测外泌体标志物CD63和TSG101的表达,对所提取的外泌体进行分析。

1.2.3 Transwell实验检测miR-18b-5p对细胞侵袭和迁移的影响 SKBR-3/PR细胞转染miR-18b-5p inhibitor后,提取外泌体,与SKBR-3细胞共培养。分组为:NC组和miR-18b-5p inhibitor组。取不同分组细胞100 μl置于上室,下室加入含10%胎牛血清的DMEM 600 μL,培养24 h取出小室,4%甲醛固定,吉姆萨染色并计数。

1.2.4 CCK-8法检测乳腺癌细胞的增殖活性 将处于对数生长期的SKBR-3细胞接种于96 孔板(细胞密度为1×104个/孔),置于37 ℃恒温培养箱中培养24、48和72 h后向每孔加入10 mL CCK-8溶液,置于37 ℃恒温培养箱中连续培养3 d,根据CCK-8 试剂盒说明书检测细胞增殖情况,酶标仪检测并记录450 nm波长处吸光度值。

1.2.5 qRT-PCR检测miR-18b-5p的表达水平 qRT-PCR 检测MCF-10A细胞和2种乳腺癌细胞SKBR-3和SKBR-3/PR中miR-18b-5p表达水平。上述细胞中加入Trizol裂解液获得总RNA。在提取总RNA时按照说明书进行实时荧光定量PCR法,95 ℃预变性10 min,95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 34 s,40个循环。获得的数据运用2-ΔΔCt的方法计算表达量。以U6作为内参。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.6 Western blotting法检测CD63、TSG101蛋白表达 收集处于对数生长期的SKBR-3细胞,加入RIPA裂解液,冰浴30 min,4 ℃条件下经12 000 r/min离心30 min,提取细胞总蛋白。采用BCA法测定蛋白浓度。取30 μg蛋白样品与上样缓冲液充分混匀后点样进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,转膜、封闭,加入CD63、TSG101一抗稀释液(1∶1 000),4 ℃孵育24 h,洗膜,加入二抗稀释液(1∶2 000)室温孵育2 h,ECL显影,应用Image J软件分析蛋白条带灰度值。

1.2.7 双荧光素酶报告基因实验 首先将NEDD9 3′-UTR序列进行扩增,构建NEDD9野生型3′-UTR荧光素酶质粒pmirGLO-WT和突变型质粒pmirGLO-Mut。将pmirGLO-WT、pmirGLO-Mut与miR-18b-5p模拟物和阴性对照转染进SKBR-3细胞,24 h后去除培养基,以PBS清洗细胞3次,弃去PBS,每孔加入100 μL 被动裂解液,室温下将培养板置于平板摇床上,轻微晃动15 min。待细胞裂解后,将每组20 μL样本转移至发光用96孔板上,并置于超级酶标仪的检测板上,分别分装100 μL的LARⅡ和Stop&Glo试剂。测量时,使用1~2 s延迟和5~10 s读数。如此循环操作直至所有样本检测完毕。使用酶标仪配套软件分析结果。相对荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性。

1.2.8 Transwell实验检测NEDD9对细胞迁移和侵袭影响 对SKBR-3转染 NEDD9过表达序列,实验分为NC组和NEDD9过表达组。通过Transwell实验检测 NEDD9对细胞侵袭和迁移的影响。具体操作同前。

1.3 统计学方法 采用t检验、单因素方差分析和q检验。

2 结果

2.1 miR-18b-5p在乳腺癌细胞中的表达 与正常乳腺癌上皮细胞MCF-10A比较,乳腺癌细胞系中miR-18b-5p相对高表达(P<0.01),其中在SKBR-3/PR细胞中表达量最高(P<0.01)(见表2)。

表2 在MCF-10A、SKBR-3和SKBR-3/PR细胞中miR-18b-5p表达水平比较

2.2 外泌体鉴定 外泌体组CD63和TSG101表达均高于对照组(P<0.01)(见表3)。

表3 外泌体蛋白标志物CD63、TSG101的表达

2.3 转染miR-18b-5p inhibitor对SKBR-3细胞迁移能力的影响 与NC组比较,转染了miR-18b-5p inhibitor的SKBR-3/PR细胞外泌体组SKBR-3细胞侵袭与迁移能力明显降低(P<0.01)(见表4),表明下调miR-18b-5p 能抑制SKBR-3细胞侵袭、迁移能力。

表4 miR-18b-5p inhibitor对SKBR-3细胞迁移能力的影响

2.4 转染miR-18b-5p inhibitor 对SKBR-3细胞增殖的影响 相对于NC组,转染了miR-18b-5p inhibitor的SKBR-3/PR细胞外泌体组抑制细胞的增殖(P<0.01)(见表5),表明下调miR-18b-5p可抑制SKBR-3细胞增殖能力。

表5 miR-18b-5p inhibitor对SKBR-3细胞的增殖抑制作用

2.5 miR-18b-5p靶向调控NEDD9 生物信息学软件 Target Scan 预测结果显示,NEDD9 3′UTR上存在潜在的与 miR-18b-5p 靶向结合的位点(见图1),说明NEDD9可能是miR-18b-5p的靶基因。根据双荧光素酶活性检测结果显示,与NC组比较,miR-18b-5p mimic组wt-NEDD9细胞中荧光素酶活性降低(P<0.05),而mut-NEDD9细胞中荧光素酶活性不受影响(P>0.05)(见表6)。

表6 双荧光素酶报告实验

2.6 过表达NEDD9对SKBR-3侵袭、迁移能力的影响 与NC组比较,NEDD9过表达组侵袭的细胞与迁移能力明显降低(P<0.01)(见表7),过表达NEDD9能够显著抑制SKBR-3细胞侵袭、迁移能力。

表7 过表达NEDD9对SKBR-3侵袭、迁移能力的影响

3 讨论

乳腺癌是成年女性最常见的恶性肿瘤,发病率较高,也是女性最常见的死亡原因之一[14]。虽然通过化疗使非转移性病人5年存活率达到60%~70%,但因化疗药物不良反应较大并且容易发生耐药,所以找到一种更有前途的治疗策略是非常迫切和必要的。外泌体近年来成为研究热点,其在肿瘤的发生、发展与转移过程中起到重要作用。肿瘤细胞分泌的外泌体携带特异性小分子或RNA,能够影响其他细胞的生物学功能,从而调节癌症进程[15]。miRNAs 因其能够作为癌症生物标志物,以及与肿瘤发生、细胞增殖、分化和凋亡等多种生理和病理发展密切相关而备受关注[16-17]。同时靶向关键调节基因和异常表达的miRNA可能是预防恶性肿瘤转移的有效策略,因此miRNA可充当一种有效的分子靶向药物对肿瘤进行治疗[18]。研究[19]表明miR-18b-5p在胆囊中过表达并作为转移形成的重要介质。XUE等[6]发现miR-18b-5p在卵巢癌中呈过表达并靶向VMA21促进肿瘤的增殖、侵袭和迁移。LI等[5]提出上调miR-18b-5p可通过下调Akt途径促进结直肠癌细胞的生长,而miR-18b-5p在乳腺癌中的表达及作用有待研究。

本研究通过qRT-PCR检测了miR-18b-5p在乳腺癌细胞SKBR-3和SKBR-3/PR和正常乳腺癌上皮细胞MCF-10A中的表达情况,结果表明miR-18b-5p在2种乳腺癌细胞系中的表达水平均明显增高,随后选取SKBR-3/PR细胞提取外泌体,并将外泌体与SKBR-3细胞共培养,发现转染miR-18b-5p inhibitor外泌体对SKBR-3细胞增殖、侵袭和迁移能力显著降低,表明miR-18b-5p具有调控SKBR-3细胞的能力。Target Scan靶基因预测软件证明NEDD9是miR-18b-5p的靶基因之一,荧光素酶报告基因实验结果表明miR-18b-5p通过靶向结合NEDD9的3′-UTR,继而抑制了NEDD9的表达,提示NEDD9可能是乳腺癌潜在的治疗靶点。过表达NEDD9可抑制乳腺癌细胞SKBR-3的侵袭与迁移能力。因此,外泌体中的miR-18b-5p可能通过靶向NEDD9调控乳腺癌SKBR-3细胞增殖、侵袭、迁移。NEDD9是核受体家族的一员,在肺癌组织与肺癌细胞系中低表达,而且 NEDD9的减少与肿瘤进展和肺癌预后不良有关[20]。WANG等[21]研究表明 NEDD9 可以调节并控制肝癌的侵袭。同时,有研究[22]发现,NEDD9在胃癌中呈低表达并抑制胃癌细胞增殖。miRNA通常通过靶向调控下游mRNA,影响其在细胞中的水平,进而调控细胞生物学功能。本研究证实了外泌体miR-18b-5p可靶向调控NEDD9。由于NEDD9介导了细胞的接触抑制作用,抑制了肿瘤细胞的转移和增殖,因此 NEDD9蛋白表达被抑制后乳腺癌细胞的增殖与侵袭能力增强,促进了乳腺癌的转移。

综上所述,miR-18b-5p在SKBR-3/PR来源的外泌体中高表达,外泌体通过上调SKBR-3 细胞中miR-18b-5p水平靶向抑制NEDD9表达,促进SKBR-3细胞的增殖、迁移、侵袭,因此miR-18b-5p可能是乳腺癌治疗的潜在分子靶点,为乳腺癌的诊断和治疗带来了积极影响。

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