抗双链DNA抗体室内质控品的制备及性能评价

曹 烨，李 蕾，张晓峰★

（1.南京医科大学附属无锡儿童医院医学检验科，江苏 无锡 214023；2.南京医科大学附属无锡人民医院医学检验科，江苏 无锡 214023）

双链DNA（dsDNA）是有核细胞内重要的遗传物质，抗dsDNA 抗体与细胞核的反应位点位于DNA分子外围区脱氧核糖核酸框架上，是系统性红斑狼疮（SLE）标志性自身抗体，参与SLE 的发病机制[1]，并在疾病进展中发挥极其重要的作用[2]。目前比较成熟的检测抗dsDNA 抗体的方法有间接免疫荧光试验（IFA）、酶联免疫吸附试验（ELISA）和近年来逐渐推广的更为高效精确的化学发光免疫试验（CLIA）[3]。依据ISO 15189 医学实验室国际通行标准要求，必须有严格的室内质量控制措施，但目前市场上尚未有高品质的商品化抗dsDNA 抗体定量室内质控品供用。本实验室通过对检测自身抗体的患者血清标本的选择性收集，自制了抗dsDNA 抗体定量室内质控品，并对该质控品的精密度及稳定性进行评估。

1 材料与方法

1.1 仪器及试剂

本实验室检测抗dsDNA 抗体的仪器为深圳亚辉龙生物科技有限公司提供的YHLO iFlash 3000 型全自动化学发光免疫分析仪，并使用该公司配套的试剂。检测前先对仪器例行状态检查和开机维护，对新装抗dsDNA 抗体试剂重新定标，确保仪器、试剂均处于性能良好状态。

1.2 质控品的制备

1.2.1 质控源血清的收集 收集若干份实验室废弃的抗dsDNA 抗体高值、低值患者血清标本，收集时剔除溶血、黄疸、脂血等外观异常及传染性疾病标志物（甲型肝炎病毒抗体、乙型肝炎病毒表面抗原、丙型肝炎病毒抗体、人类免疫缺陷病毒抗体和梅毒抗体等）阳性的标本。将这些血清吸到Eppendorf 离心管中，并编号记录抗dsDNA 抗体浓度和血样大致体积，置于-20℃冰箱中冷冻保存。

1.2.2 质控品制备 收集标本数量足够后，从冰箱中取出所有血样，室温解冻融化。取一个洁净的250 mL三角烧瓶，先将低值血清用吸管移入烧瓶中，充分混匀，用吸管去除可能出现的大团纤维蛋白沉淀。用少量含防腐剂的亚辉龙化学发光免疫分析仪配套的稀释液和高值血清调节至约0.5 倍cut-off 值，配制低值质控血清，56℃灭活30 min 后室温振摇60 min，分装在10 mL 的一次性塑料尿沉渣管中，拧上盖子在3500 rpm 的转速下离心10 min。将上清液再次小心吸入洁净的三角烧瓶中，振摇2 min 确保充分混匀，按200 μL/ 管分装在1.5 mL 的Eppendorf 离心管中，盖紧密封，贴上标签，做好标记，置于-20℃冰箱中冷冻保存待用。高值质控血清制备时，按照约5 倍cut-off 值的预期靶值估算需要加的血样量，融化混合，各处理步骤同上述低值质控血清。用低浓度血清和含防腐剂的亚辉龙化学发光免疫分析仪配套的稀释液配制高值质控品，重复上述灭活、离心、分装、标记步骤，置于-20℃冰箱中冻存备用。

1.3 自制质控品性能评价

1.3.1 自制质控品初始靶值和批内精密度（瓶间差）的测定 从-20℃冰箱中各取20 管自制高值、低值质控品，室温放置30 min 充分解冻融化，编号、去盖后上机检测抗dsDNA 抗体浓度，分别记录20 管自制高值、低值质控品的检测结果，并计算平均值（x） 、标准差（s） 、变异系数（CV%）。

1.3.2 自制质控品稳定性测定 本实验室日常每周二、周五做2 次标本检测，每个测定日随机取出自制高值、低值质控品各1 管，复融后，随同测定标本一起上机检测，连续记录4 个季度抗dsDNA 抗体浓度的检测结果，分别计算每季度组的x、s、CV%，比较初始靶值与各季度组均值和全年累积均值的差异性，评价自制质控品在-20℃保存状态下的稳定性。首季度以初始靶值的均值为中心线，第二至第四季度以累积均值为中心线，以相应的x ±2s 为“警告”线，x±3s 为“失控”线，动态绘制各个季度Levey-Jennings质控图，以13s、22s、R4s、41s、10X作为“失控”规则，对出现“警告”或“失控”的结果进行原因分析，并采取相应措施及时纠正。

1.4 统计学处理

采用SPSS 21 软件进行数据分析，计算各组x、s、CV%，多组间比较使用单因素方差分析，两两均数比较采用最小显著性差异法（LSD），P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 自制质控品初始靶值及批内精密度（瓶间差）评价

自制高值、低值质控品批内CV% 分别为5.148%和5.510%，见表1。CV% 值在试剂厂家提供的可接受范围内（≤10%），符合美国临床实验室改进修正案（CLIA 88）中能力验证对检测项目分析质量的要求[4]。结果显示，自制质控品批内精密度较高，瓶间差较小，重复性较好。

表1 自制高值、低值抗dsDNA 抗体质控品批内精密度检测结果（n=20，U/mL）

2.2 自制质控品稳定性评价

2.2.1 批间精密度评价 高值质控品第一季度到第四季度的CV% 分别为6.155%、6.341%、4.536%、4.807%，低值质控品第一季度到第四季度的CV% 值略高，分别 为7.550%、9.545%、5.478%、8.511%。 高 值、低值质控品全年的季度批间CV% 分别为5.388%、7.612%（见表2）均在试剂厂家提供的试剂说明书中的可接受范围内（≤15%），符合CLIA 88 中能力验证对检测项目分析质量的要求[4]。

2.2.2 初始靶值及各季度均值与全年累积均值比较 自制高值、低值质控品初始靶值、各季度及全年累积x、s、CV% 见表2。经单因素方差分析，自制高值、低值质控品各组间均值统计结果分别为F=0.093，P=0.993 ；F=0.629，P=0.678，二者比较差异无统计学意义（P＞0.05）。自制高值、低值质控品初始靶值及各季度均值分别与全年累积均值比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。结果表明，在-20℃保存条件下，高值、低值质控品的稳定期至少12 个月。

表2 自制高值、低值抗dsDNA 抗体质控品各季度均值与累积均值的比较（U/mL）

2.2.3 自制抗dsDNA 抗体质控品的Levey-Jennings 质控图 通过20 管自制高值、低值质控品检测结果，统计出x、s、CV%，设定靶值，制定室内质控的控制线，绘制第一季度Levey-Jennings 质控图。自第二季度起，以后每个季度的Levey-Jennings 质控图均依据之前所有质控数据的累积均数和累积标准差绘制，图1、图2 分别为两种自制质控品第一、第四季度的质控图。高值质控品全年共出现违反12s“警告”规则7 次，频率为6.7%（7/105）；低值质控品全年共出现违反12s“警告”规则9 次，频率为8.6%（9/105）。二者平均“警告”频率为7.62%（16/210）。两种质控品第一、第二、第三季度均未出现违反13s、22s、R4s、41s、10X“失控”规则现象，仅第四季度高值质控品录得违反22s“失控”规则一次（第16 至第17 次序号），见图2。

图1 第一季度Levey-Jennings 质控图

图2 第四季度Levey-Jennings 质控图

3 讨论

抗dsDNA 抗体可通过直接结合自身抗原或其他间接方式形成免疫复合物，沉积在肾小球基底膜，触发补体级联反应，导致组织损伤；还可穿入活细胞中，调节基因表达，甚至可诱导肾细胞表型的促纤维化改变[5]。抗dsDNA 抗体滴度与SLE 等疾病的活动度密切相关，动态测定其浓度对SLE 的诊断、疗效观察和预后判断均有重要意义[6-7]。近年来，越来越多的实验室开展了抗dsDNA 抗体定量检测项目。保证抗dsDNA 抗体检测结果的准确性和可靠性至关重要，其中做好室内质量控制是一个重要手段，但目前市场上少有高质量的抗dsDNA 抗体定值质控品提供，且价格高昂。理想的质控品应具备人血清基质、无传染性、添加剂和抑菌剂的数量尽可能少、瓶间变异小、稳定性好等优点[4]。国内有学者使用自制抗环瓜氨酸肽抗体、抗角蛋白抗体、抗核周因子质控品来代替商用质控品，性能良好[8]。本实验室自制的高值、低值抗dsDNA 抗体质控品，批内变异CV% 分别为5.148%和5.510%，瓶间差较小，全年批间总变异CV% 分别为5.388% 和7.612%，符合试剂厂家说明书提供的批内≤10%、批间≤15% 的变异要求，说明本实验室的自制质控品有较好的精密度。自制高值、低值质控品随同测定标本一起上机连续检测4 个季度，初始靶值及各季度均值与全年累积均值比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。自制抗dsDNA 抗体质控品的Levey-Jennings 质控图显示，高值、低值质控品均出现违反12s 规则的现象，“警告”总频率为7.62（16/210），一年内仅第四季度出现违反22s“失控”规则1 次。“警告”和“失控”的出现可能是由于实验室温度、湿度等环境条件的不稳定，以及不同实验室技术人员操作的微小差异或仪器的不稳定等因素导致。出现“警告”或“失控”后，经复测质控品或重新校准后再复测质控品，其结果均又回到2s 范围以内的在控状态，表明自制质控品的检测可以较好监视检测系统的性能状态。精密度分析和质控图显示，低值质控品变异系数较高值质控品略大，应该与0.5 倍的cut-off 低水平质控靶值设定有直接关系，水平越低越趋近于分析方法的线性边界，变异度趋大，但结果仍处于临床阴性值区域，因此并不影响质控价值。这些数据分析表明，自制的抗dsDNA 抗体室内质控品精密度较高，在-20℃保存条件下，自制质控品一年内保持稳定，满足临床实验室室内质控品的技术要求。

值得注意的是，为确保顺利制备质控品，提高质控品的稳定性，混合质控血清在混匀后必须在室温下振摇60 min，这样可以让混合血清中相应的抗原抗体充分进行中和反应，然后离心去除沉淀物能减少潜在的干扰。另外，为了避免质控品蒸发和外溢对结果造成影响，分装进Eppendorf 离心管后应注意必须保证离心管密封良好，分装体积应至少在200 μL 以上，并放在管架上保持直立状态，置于-20℃冰箱中冷冻保存。本实验室在长期的工作总结中，利用实验室废弃的血清标本先后成功制备了几乎“零成本”的抗dsDNA 抗体、抗ANA 抗体、抗CCP 抗体、抗MP抗体、抗EBV 抗体等多种室内质控品，性能均良好。这些自制质控品的应用既保证了实验室结果的准确和质量的稳定，同时又大大降低了科室的支出，对检验科以及医院的降本增效工作作出了应有的贡献。