miR-29b调控HBP1信号通路与RA患者PBMs的关系

张 静，崔国峰，刘 丹，李 娟★

（1. 西安市第五医院风湿免疫科，陕西 西安 710082 ；2. 郑州大学附属洛阳中心医院骨科，河南 洛阳 471009）

类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis，RA）是一种主要累及手足小关节的慢性全身性炎症性疾病。RA 的特点是对称的多发性关节炎，由于自身免疫性炎症反应集中在滑膜，可导致关节畸形（特别是掌指关节、近端指间关节）。外周血中CD14+、CD16+外周血单核细胞（Peripheral blood monocytes，PBMs）的含量较小，仅占PBMs 的10% 左右。研究表明，在慢性炎症性疾病（如RA）患者的外周血中，非经典型PBMs 增加；在RA 患者的滑液中也发现非经典型PBMs 显著增加，并且具有表型活性[1]。miR-29 家族是许多疾病中最常见的miRNAs。在本研究中，我们提供了miR-29b 通过抑制HBP1 信号通路增强RA 患者PBMs 对凋亡抵抗作用的证据支持，这有助于更好地理解转录后分子改变和全身性诱导RA 对凋亡抵抗之间的关系。

1 资料和方法

1.1 临床资料

选取2020 年6 月至2021 年12 月于西安市第五医院就诊的RA 患者（n=20）。其根据ACR 1987 年修订的RA 分类标准诊断RA 至少1 年，DAS 28 得分为（6.2±0.8）分；其中有女性15 例，男性5 例。

1.2 方法

使用ViaFect 试剂建立稳定表达外源性HBP1 的THP-1 细 胞（THP-1/HBP1）， 用MISSION 转 染 试剂将miR-29b 模拟物（miR-29b mimics）或模拟物阴性对照（mimics negative control，Mimics-NC）转染PBMS 48 h。使用ProtoScript® Ⅱ逆转录酶（New England Biolabs，Ipswich，MA，USA）对RNA 样本进行逆转录，然后使用ABI Prism 7300 仪器和SYBR Green Reducts 进行qPCR 分析。以18S RNA 或人U6 snRNA 为内对照，采用2-△△CT 法比较不同靶点的相对表达强度。用于基因表达分析的引物如下：HBP1（基因登录号NM_001244262.1）、CD14（基因登录号NM_000591.4）、18S（基因登录号M10098.1）。根据我们之前的工作进行免疫印迹（Western blotting）处理。用兔抗-HBP1 和兔抗-β- 肌动蛋白两种不同的一抗进行膜孵育。利用2.0 Dry-Down PCR 克隆试剂盒将人HBP1 3'-UTR 中假定的miR29b 结合位点DNA 片段（约1.1 kb）亚克隆到pGL4-Luc 报告载 体。 使 用QuikChange Site-Directed Mutagenesis试 剂 盒（Agilent，Santa Clara，CA，USA） 进 行HBP1/3'-UTR 中miR-29b 结合位点的定点突变。对于报告基因的检测，用ViaFect 将野生型报告基因结构pGL4-Luc-HBP1/ 3'-UTR 或突变的报告基因结构与miR-29b mimics 或Mimics-NC 一起转染到5×106NIH/3T3 细胞。48 h 后，收集细胞，用荧光素酶报告试剂盒测定相对荧光素酶活性。

1.3 统计分析

每次化验至少进行3 次独立实验。数据以Mean±S.E.M. 表示，使用GraphPad Prism 5 软件进行统计分析。使用正态概率图确定数据正态性，并根据需要使用t检验或单因素方差分析（ANOVA）进行比较。用Pearson's 线性回归法分析参数之间的关系。P值＜0.05 为有统计学意义。

2 结果

使用Target Scan 和miRDB 数据库筛选出20 个可能是miR-29b 潜在的靶点基因，其中HBP1 是一种与凋亡相关的转录因子。见图1。

图1 数据库筛选MiR-29b 潜在基因

在RA PBMs 中，HBP1 表达水平与miR-29b 的表达水平具有负相关性（n=20，P=0.0004，见图2）。

图2 HBP1 与PBMs 的miR-29b 表达负相关

无论是在转录水平还是在翻译水平方面，在正常PBMs 细胞中转染miR-29b mimics 均显著抑制HBP1的表达。见图3。

图3 miR-29b 增强对HBP1 抑制作用

野生型pGL4-HBP1 3'UTR-Luc（WT 组）报告质粒和miR-29b mimics 共转染后，荧光素酶报告活性降低约48.7%，而突变的pGL4-HBP1 3'UTR-Luc（Mu 组）则消除了miR-29b 对荧光素酶报告活性的抑制。因此，HBP1 可以作为miR-29b 信号转导的直接下游靶点。见图4。

图4 miR-29b 靶向HBP1 位点确定

3 讨论

RA 在许多细胞类型中具有对凋亡的抵抗作用，包括T 细胞、RA-FLS 和PBMs。HBP1 是一种多功能转录因子，在多种组织和细胞类型中参与多种细胞进程，包括衰老诱导、凋亡调节、分化终止和肿瘤抑制[2]。HBP1 可从根本上调节细胞凋亡的激活。例如，HBP1可通过抑制Mdm2 介导的p53 泛素化增强p53 的稳定性，从而促进细胞死亡[3]。p21 是p53 依赖的细胞凋亡的重要介质。因此，HBP1 被认为是一种有效的肿瘤抑制因子。在未转化的细胞（即颗粒细胞）中，颗粒特异性的HBP1 切除可导致小鼠颗粒细胞凋亡信号减少，促进卵泡生长和卵母细胞生成，从而对卵巢储备功能进行调控[4]。

通过对PBMs 异位miR-29b 表达的分析，我们已经确定HBP1 是潜在的下游靶点。用Pearson's 线性回归分析确定RA 患者（n=20）PBMs 中miR-29b和HBP1 mRNA 水平之间的相关性（图1）。并通过荧光素酶报告实验进一步证实了miR-29b 可以与HBP1的3'UTR 直接结合（图2）。重要的是，HBP1 的稳定表达可以消除异位miR-29b 表达。研究发现：HBP1的促凋亡作用在不同的系统中存在明显差异，同时HBP1 的表达受表观遗传机制的严格调控[5-6]。包括miR-21、miR-19a 和miR-155 在内的多种miRNA已被报道在转化细胞和正常细胞中直接靶向HBP1的3'UTR。因此，我们目前的研究确定miR-29b 是PBMs 中HBP1 信号的直接上游调节因子。而miR-29b/HBP1 通路是否也在T 细胞和滑膜细胞中起作用有待更深入的研究。

综上所述，miR-29b 可与HBP1 结合，并具有抑制其在PBMs 中转录的作用。综合分析研究结果可知，miR-29b 具有调控HBP1 信号通路改变RA 患者PBMs 对凋亡抵抗的作用。