溶瘤病毒调控肿瘤微环境及联合治疗的研究进展

伊萌 ，杨全军，琚姝，刘建飞

1.上海三维生物技术有限公司，上海 200083；2.上海市第六人民医院（上海交通大学附属第六人民医院）药剂科，上海 200083

溶瘤病毒是临床上的新型肿瘤疗法，可精准靶向杀灭肿瘤细胞，早在1904年，有临床试验证明，白血病患者在用药后，体内白细胞的数量迅速减少。因此，病毒成为临床研究的新研究方向，但由于病毒的种种限制因素，一直未获得较大进展。直至20世纪90年代后，基因工程技术逐步成熟，才得以解决上述问题，使得各种具有肿瘤靶向性病毒或天然病毒受到改造后进入临床试验，取得了显著效果[1]。本文就溶瘤病毒调控肿瘤微环境的相关机制及联合疗法叙述如下。

1 溶瘤病毒和肿瘤微环境

1.1 溶瘤病毒

溶瘤病毒主要通过改变细胞结构来杀灭肿瘤细胞，P53和胸腺激酶的突变是肿瘤细胞中常见的基因突变，这些基因突变致使肿瘤细胞不仅不会自然凋亡，还会无限增殖。因此，肿瘤细胞中的这些特定突变被用作临床研究的目标，对相应的病毒进行定向修饰，可大量繁殖突变肿瘤细胞，使其杀灭肿瘤细胞。例如，临床二期中的重组牛痘病毒，通过敲除其DNA中的胸腺激酶基因，可减少低分裂细胞，增加高分裂细胞，从而取得靶向性细胞杀灭能力。例如，P53基因突变或缺失是许多肿瘤中常见的现象，而P53是正常细胞的抗病毒反应参与物之一，因此，该基因的突变正适合靶向性地大量复制溶瘤病毒。此外，在溶瘤病毒靶向杀伤肿瘤细胞的基础上，还可搭配（interleukin-2,IL-2)/（interleukin-12,IL-12）和（Human granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）等细胞促炎因子，可激活和浸润免疫细胞，协同免疫系统共同清除肿瘤细胞[1]。

目前，国际临床上全面批准上市的溶瘤病毒产品共有4款，包括拉脱维亚Sia Latima公司治疗黑色素瘤和其他恶性肿瘤的Rigvir，上海三维生物公司治疗鼻咽癌的安柯瑞，美国安进旗下Biovex治疗黑色素瘤的 Imlygic（Talimogene laherparepvec）及日本第一三共公司治疗胶质细胞瘤的Delytact。其中：①Delytact（teserpaturev/G47Δ)是由第一三共和东京大学Tomoki Todo团队共同开发的第三代溶瘤单纯疱疹病毒1型（herpes simplex virus-1，HSV-1），也是首例在人体中测试的第三代溶瘤性HSV-1。该溶瘤病毒产品具有三重突变，在第二代HSV-1 G207的基础上加入了新的缺失突变（敲除了α47），不但强化了肿瘤细胞中的病毒选择复制性和抗肿瘤活性，还保留了G207的用药安全性。该药一度被日本厚生劳动省（Ministry of Health, Labour and Welfare，MHLW）授予孤儿药称号和先驱疗法认定。Delytact于2021年6月在批准在日本上市，并于8月以每剂143万日元的价格定价上市。研究此药的Tomoki Todo博士与东京大学，曾针对复发性胶质母细胞瘤患者，开展单臂2期临床试验的结果，试验结果表明：Delytact可有效提高放疗和化疗的胶质母细胞瘤残留或复发患者的1年生存率，试验结束后，原本接受了Delytact治疗的患者中92%仍然存活，而通常情况下这些患者的1年生存率仅有15%左右。②安进旗下Biovex的Imlygic于2015年经美国食品药品监督管理局（Food and Drug Administration,FDA）批准，专用于黑色素瘤治疗，更是获得FDA批准的首例产品，又于2016年在欧洲和加拿大获批上市。③首例获得国际临床和市场认可的中华人民共和国国家食品药品监督管理总局（China Food and Drug Administration，CFDA），为2005年批准的三维生物的安柯瑞（H101），临床上通过利用基因工程技术，删减5型腺病毒而制作出的新型溶瘤病毒，经多次临床试验后，该药被批准可与化疗药物联合使用治疗晚期鼻咽癌。此外，还有多项研究显示，H101在其他肿瘤的治疗上，同样有着不错的效果［2-3］，例如：肝细胞癌、胰腺癌、非小细胞肺癌等。除了上述几款获取批准的溶瘤病毒产品外，还有许多其他溶瘤病毒产品正在进入临床试验阶段。例如：2020年4月，复诺健生物自主研发的全球首个携带4个协同性免疫调控因子的新型溶瘤病毒产品VG161在澳洲完成了一期临床的首例病人给药。2020年5月，深圳亦诺微医药首个产品T3011（瘤内注射），在中国和澳洲启动临床I期试验，并获得美国FDA临床批准，将在世界知名的4家癌症中心陆续开展。

1.2 肿瘤微环境

肿瘤微环境是肿瘤形成和加重的关键条件，可在加强药物耐药性的同时引发免疫逃逸和恶性转移，这对肿瘤的治疗进展造成了极大的局限。肿瘤微环境由肿瘤基质（由肿瘤相关成纤维细胞、免疫细胞和血管内皮细胞构成）和细胞外基质、氧气水平及pH值共同构成。一方面肿瘤细胞会分泌大量刺激生长因子、细胞因子和趋化因子，可对血管细胞、免疫细胞和基质细胞形成有效招募，进而发生异变，形成器官样组织[4]。另一方面，肿瘤微环境中可分泌肝细胞生长因子、纤维母细胞生长因子和趋化因子配体12等细胞生长因子，可在促进恶性肿瘤细胞成长的同时，扩大肿瘤微环境，造成恶性增殖。

2 溶瘤病毒对肿瘤微环境的调控机制

2.1 溶瘤病毒对肿瘤微环境中免疫细胞的调控

①溶瘤病毒激活免疫细胞。肿瘤在生长中，肿瘤细胞的衰亡会导致炎症水平快速增高，导致肿瘤微环境受到免疫细胞浸润，从而导致肿瘤细胞转化成生长因子β、白介素10或上调（cluster of differentiation 47，CD47）/（programmed cell death-Ligand 1,PD-L1）等蛋白质表达实现免疫逃逸。同时肿瘤细胞会逐渐促使免疫细胞发生异变，它向有利于肿瘤生长的方向分化，最终形成一个“永不愈合”的伤口。溶瘤病毒可以针对肿瘤细胞并释放肿瘤相关抗原，诱发内源性危险相关分子模式，以及病毒自身诱导的病原相关分子模式，为了激活免疫系统，也可以诱导肿瘤细胞表达大量抗原表位以激活肿瘤特异性免疫应答[5-6]。而溶血病毒可促进免疫细胞的成熟和浸润，增强免疫致死率的强特异性。例如，表达GM-CSF的溶瘤性呼吸肠病毒在肿瘤微环境中激活并促进抗原呈递细胞的分化和成熟。也有报道称，装载溶瘤腺病毒的免疫共刺激分子（clusters of differentiation 40，CD40）、（tumor necrosis factor ligand superfamily member 4，OX40）等胚胎性基因，不仅可靶向杀伤肿瘤细胞，还能刺激分子配体表达，帮助肿瘤部位抗原提细胞，预警与辨识肿瘤细胞。以此提高免疫细胞靶向性杀伤肿瘤的效率，且联合免疫检查点抑制剂用药，可取得良好协同治疗效果[7-8]。此外。溶瘤病毒还能通过表达肿瘤坏死引子α、白介素1β和补体等炎症趋化因子，内皮细胞选择素表达上调是T细胞侵袭的关键信号。

②溶瘤病毒抑制免疫抑制性细胞。在肿瘤微环境中，还有不少免疫抑制性细胞，例如，T细胞调控细胞、肿瘤相关巨噬细胞、髓源衍生抑制细胞等。这些细胞在免疫抑制的肿瘤微环境中是活跃的，可分泌转化生长因子β、白介素10等免疫抑制因子来抑制效应T细胞和自然杀伤细胞及树突细胞的分化成熟，它还能识别肿瘤抗原。溶血性病毒抑制这些细胞的活性，减少肿瘤微环境的免疫抑制。例如，有研究报道发现，小鼠黑素瘤或淋巴瘤模型，瘤细胞呼出的呼出病毒可通过内吞作用进入骨髓间充质干细胞，（toll-like receptor 3，TLR3）识别病毒的双链裂解细胞,最终诱发virus-independent复制删除MDSCs的免疫抑制功能,从而增强抗肿瘤免疫应答[9]。在弱免疫原性小鼠4T1原位乳腺癌模型中，OH等人通过溶瘤腺病毒促进核心蛋白多糖的表达，抑制肿瘤微环境中Tregs的生长，导致DCN与胰岛素样生长受体结合，抑制激活（transforming growth factor-β,TGF-β）下游信号通路。这导致肿瘤微环境中的免疫抑制降低。同时，还可协同表达白介素12来诱导T细胞和NK细胞活化，激活抗肿瘤免疫机制，这也是临床发现的另一种增强免疫介导系统的抗肿瘤效应，为溶瘤病毒调控肿瘤微环境提供了新的思路[11]。

2.2 溶瘤病毒清除肿瘤相关成纤维细胞

肿瘤相关成纤维细胞是构成肿瘤微环境的必要条件，可以多途径方式保护肿瘤细胞，同时还可加速肿瘤细胞增殖与转移。例如，细胞粘附因子（cell adhesion factor，CAF）可上调肌球蛋白Ⅱ、α5β1整联蛋白、血小板源性生长因子受体α的表达，这引发了收缩和牵引，导致纤维连接蛋白在CAF中的线性排列，从而促进了前列腺癌细胞的定向转移。此外，CAF也保护肿瘤细胞不受T细胞的损伤，因为它不能很好地呈现抗原，同时还可调高程序性死亡配体2和人凋亡相关因子配体的表达，以此诱导CD8+T细胞凋亡，并不断杀灭效应T细胞，最终形成免疫机制[12]。

2.3 溶瘤病毒抑制血管生成

肿瘤的形成、发展和转移与内源性发生密切相关。肿瘤细胞分泌大量的血管内皮生长因子、缺氧诱导因子、基质金属蛋白酶和外泌体小分子，或刺激形成异常血管。这些血管在为肿瘤细胞供给能量的同时，也会快速地选择性分化，侵袭性和转移性得到明显增强，同时还可对免疫细胞的肿瘤破坏性产生相应的抵抗性能[13-14]。然而，溶血性病毒直接杀伤肿瘤相关血管内皮细胞，导致血管生成因子表达降低，如：在BMS乳腺癌分级模型中，表达肿瘤转移抑制蛋白的溶瘤腺病毒可增强对肿瘤细胞的毒性，抑制VEGF和MMP-14的活性，抑制肿瘤血管生成，防止肿瘤细胞发生远端转移。此外，有报道称，在成髓细胞瘤小鼠模型中，麻疹溶瘤病毒可抑制血管细胞生长，阻断肿瘤转移，提高小鼠的存活率[15]。

3 溶瘤病毒联合免疫检查点抑制剂治疗

免疫检查点机制是人体免疫系统的自我保护机制，可避免免疫系统误杀正常细胞中的重要信号节点。当机体处于健康状态时，机体内大多只有一个免疫检查点。然而，在许多恶性肿瘤发生后，肿瘤细胞中免疫检查点明显增多，来混淆免疫系统的检查机制，导致肿瘤细胞未受到免疫系统节制，从而大量繁殖。在当下的免疫检查点蛋白质研究中，多以PD-L1/PD-1和CRLA-4作为靶点的单克隆抗体药物为主，在许多案例中取得不错的用药效果[16]。此外，淋巴细胞激活因子3、T淋巴细胞免疫球蛋白黏蛋白3的抑制剂均已进入临床试验。免疫检查点抑制剂治疗虽然屡有效果，但因为肿瘤微环境的抑制和阻断机制以及肿瘤细胞的异质性和免疫相关不良反应等客观因素，所以该药在治疗中仍具有一定局限性。例如，在淋巴细胞浸润少或PD-L1表达水平较低的许多肿瘤疾病中，采用PD1单抗药物治疗，普遍缺乏理想的效果。同时，许多动物研究表明，联合使用溶瘤病毒和免疫检查点抑制剂，可提高总体好转率，因此，临床上在癌症治疗中，普遍提倡以溶瘤病毒和免疫检查点抑制剂联合治疗为主[17-18]。

①溶瘤病毒和PD1/PD-L1抑制剂的联合治疗。PD1/PD-L1抑制剂是激活抗肿瘤免疫应答的关键，也被用于抑制微肿瘤环境形成，但该疗法效果不甚理想，而联合溶瘤病毒共同治疗可使肿瘤微环境中不断吸收T细胞，刺激免疫细胞活化，表达免疫检查点拮抗抗体，以此加强免疫检查点抑制剂效果[19-20]。例如，在PD-L1低表达或不表达的结肠癌小鼠模型中，溶瘤痘苗病毒联合PD-L1抑制剂治疗可诱导肿瘤中PD-L1的增加。同时，溶瘤病毒可以诱导肿瘤组织中更多的免疫细胞入侵。联合PDL1抑制剂治疗，肿瘤清除率一般较高。它可为更多肿瘤疾病的治疗提供可行性方案。例如，在人类黑色素瘤免疫缺陷小鼠模型中，溶瘤腺病毒在预移植人骨髓造血干细胞后，帮助小鼠重建免疫系统，联合PD-1抑制剂可发挥重要协同机制，最大程度上缩减肿瘤体积，提升抗肿瘤效果。临床实验中，如转移性黑色素瘤已经到达Ⅲ～Ⅳ期，无法切除则可采用T-VEC和PD-1抑制剂联合治疗，可获得90%左右的总体缓解率[21-22]。

②溶瘤病毒和CTLA-4抑制剂联合治疗。除却PD1/PD-L1抑制剂外，联合溶瘤病毒和CTLA-4抑制剂在临床治疗肿瘤疾病也颇有效果，例如在黑色素瘤二期无法切除的临床实验中，给予T-VEC和Ipilimumab联合治疗，患者的总体缓解率高出单一用药的患者两倍左右。

综上所述，在肿瘤疾病治疗中，灵活地运用溶瘤病毒调控肿瘤微环境，使其产生免疫杀伤机制，再配合免疫检查点抑制剂药物，能够显著提升抗肿瘤效果，具有可观的发展前景。