高效液相色谱法测定血液透析器中N-甲基吡咯烷酮

2022-02-26沈永郭利娟薄晓文孟凯

化学分析计量 2022年2期

沈永，郭利娟，薄晓文，孟凯

(山东省医疗器械和药品包装检验研究院，国家药品监督管理局生物材料器械安全性评价重点实验室，山东省医疗器械生物学评价重点实验室，济南 250101)

近年来，随着人口老龄化的加深，糖尿病、高血压患者越来越多，致使终末期肾病急剧增加，从而导致肾脏替代治疗的需求持续增长［1-3］。血液透析、腹膜透析和肾脏移植是目前现有的肾脏替代疗法，其中血液透析普遍应用于肾脏替代治疗［4］。血液透析是治疗急、慢性肾功能衰竭和某些急性药物、毒物中毒的有效方法［5］，主要是利用透析膜通过弥散及吸附等机理去除中小分子毒素，通过超滤和渗透清除体内残留过多的水分，达到血液净化的目的［6］。血液透析器是血液透析系统的主要组成部分，通常由空心纤维(透析膜)、外壳、端盖和医用异氰酸酯密封胶组成。常见的高分子合成膜材料有聚砜、聚酰胺、醋酸纤维素等，其中聚砜膜具有优良的生物相容性、良好的渗透性能等优点，因此被广泛应于血液透析器［7］。

聚砜膜的生产工艺通常采用浸没沉淀相转换法［8-10］。聚砜材料在N-甲基吡咯烷酮（NMP）中可形成均相溶液，聚砜溶液与非溶剂相互作用形成聚砜膜。据研究报道，NMP 具有刺激作用和潜在的生殖毒性，经吸收后，以消化系统为主要的靶器官，还有可能影响中枢系统，从而影响人体机能［11-13］。血液透析器为三类高风险医疗器械，临床使用时与患者血液直接接触，故血液透析器中残留的NMP 可能会迁移至患者血液，从而给患者造成较高的安全风险，所以需对血液透析器中NMP 溶出量进行研究，以准确评估血液透析器的安全性和有效性。

目前，在药物、纺织品及食品包装材料中NMP的主要检测方法有高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用、气相色谱-质谱联用等方法［14-16］。目前尚无高效液相色谱法测定血液透析器中NMP 溶出量的报道，且无相关的测试方法标准。笔者以超纯水为替代溶剂，模拟临床使用条件浸提血液透析器中NMP 的溶出量，采用高效液相色谱法进行测定。该方法专属性强、灵敏度高、精密度及准确度好，可测定血液透析器中NMP 的溶出量，以评估血液透析器中NMP 临床接触量，此外，该分析方法成本低，易于推广，具有较好的应用前景。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Waters Arc 型，沃特世科技（上海）有限公司。

滚压泵：JHBP-2000 型，广州市暨华医疗器械有限公司。

电子天平 XP205 型，感量为0.01mg，瑞士梅特勒托利多集团。

pH 计：Seven Excellence 型，梅特勒-托利多（香港）控股有限公司。

数显电子恒温水浴锅：HH-8 型，常州国华电器有限公司。

超纯水系统：Milli-Q A10 型，美国密理博公司。

NMP 对照品：纯度（质量分数）为99.8%，批号为9C-11-23，广州佳途科技股份有限公司。

甲醇、乙腈：色谱纯，德国默克公司。

磷酸：优级纯，国药集团化学试剂有限公司。

磷酸二氢钾、无水磷酸氢二钾：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

实验用水为超纯水，由Milli-Q A10 型超纯水系统制备。

血液透析器样品：山东新华医疗器械股份有限公司。

1.2 溶液配制

NMP 系列对照品工作溶液：精密称取NMP 对照品54.19 mg 于50 mL 棕色容量瓶中，用超纯水稀释并定容至标线，得质量浓度为1.081 6 mg/mL的NMP 对照品储备液，再用逐级稀释法配制成NMP 的质量浓度分别为0.054 08、0.108 2、0.216 3、0.540 8、1.08 2、2.163、5.408、10.82、21.63 μg/mL 的系列对照品工作溶液。

磷酸盐缓冲溶液：精密称取磷酸二氢钾2.085 0 g、无水磷酸氢二钾0.217 5 g 于1 L 容量瓶中，用超纯水溶解、稀释，加入磷酸1.0 mL，再用超纯水定容至标线。

1.3 色谱条件

色谱柱：XSelect®HSS T3 柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm，美国沃特世公司）；流量：0.5 mL/min；检测波长：200 nm；柱温：25 ℃；进样体积：100 μL；流动相：乙腈-磷酸盐缓冲溶液（体积比为3∶97），洗脱方式：等度洗脱。

1.4 样品处理

1.4.1 样品供试液

（1）预冲。参照血液透析器临床使用说明书，按照血液透析器预冲示意图（图1）所示连接血液透析器及硅胶管路，形成2 个分别独立的循环系统，在玻璃烧杯中各加入1 000 mL 超纯水，通过滚压泵注满整个闭路系统，以200 mL/min 的流速分别冲洗血液透析器血液侧与透析液侧，冲洗完毕后吹入氮气去除血液透析器中的液体。

图1 血液透析器预冲示意图

（2）浸提。按照血液透析器NMP 浸提示意图（图2）所示连接血液透析器及硅胶管路形成闭合循环系统，溶剂瓶中加入500 mL 水，通过滚压泵在（37±1） ℃下以200 mL/min 的流量循环5 h，循环完毕后将硅胶管路及血液透析器中浸提液转移至溶剂瓶，溶剂瓶中加入水至溶液体积为600 mL，即得样品供试液。

图2 血液透析器NMP 浸提示意图

1.4.2 空白对照液

移取500 mL 水于溶剂瓶中，采用硅胶管形成闭合循环回路，通过滚压泵在（37±1） ℃下以200 mL/min 的流量循环5 h，将循环管路中水转移至溶剂瓶，溶剂瓶中加入水至溶液体积为600 mL，即得空白对照液。分别取样品供试液、空白对照液经0.45 μm 滤膜过滤，待测。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

甲醇、乙腈、水、缓冲盐为高效液相色谱常用流动相，磷酸缓冲盐有助于改善色谱峰峰形，乙腈的紫外截止吸收波长较甲醇低，故选乙腈与磷酸盐缓冲液为流动相。NMP 紫外最大吸收波长为200 nm，故选用200 nm 为检测波长。NMP 极性较大，在色谱柱保留较弱，故选用XSelect®HSS T3 极性色谱柱为分析柱，以增强NMP 在色谱柱的保留。

2.2 浸提方式与浸提溶剂的选择

血液透析器在临床应用时，血液侧与人体直接接触，透析液侧与人体间接接触。血液透析器为三类高风险医疗器械，故因此将血液透析器的血液侧与透析液侧连接形成闭合回路进行循环制备样品供试液。NMP 易溶于水、乙醇、乙醚、丙酮等溶剂，考虑到血液透析器组成材料的耐受性以及经济环保等因素，选取超纯水为浸提溶剂，以减少非目标化合物干扰。

2.3 专属性试验

分别取适量空白对照液、NMP 对照品溶液及样品供试液，按1.3 色谱条件分别测定，高效液相色谱图见图3。由图3 可知，NMP 对照品溶液的保留时间约为7.8 min，样品供试液中NMP 的保留时间与空白对照溶液基本一致，NMP 色谱峰峰形良好，与邻近色谱峰分离度均大于1.5，空白对照液对分析测定无干扰，满足试验要求，表明该方法专属性良好。

图3 高效液相色谱图

2.4 线性方程与检出限

取NMP 系列对照品工作溶液，按1.3 色谱条件进行测定，以NMP 的质量浓度（x）为横坐标，以色谱峰面积（y）为纵坐标，绘制标准工作曲线，得NMP 的线性方程为y=807 374x+47 765，相关系数r=0.999 9，表明NMP 的质量浓度在0.054 08～21.63 μg/mL 范围内与色谱峰面积的线性关系良好。

用超纯水对1.2 配制的NMP 对照品储备液逐级稀释并按1.3 色谱条件进行测定，根据《中国药典》2020 版9101 药品质量标准分析方法验证指导原则中信噪比法测定NMP 的检出限和定量限［17］。当NMP 的质量浓度为0.027 04 μg/mL 时，信噪比约为3；当NMP 的质量浓度为0.054 08 μg/mL 时，信噪比约为10，故该方法NMP 的检出限与定量限分别为0.027 04、0.054 08 μg/mL。

2.5 精密度试验

移取质量浓度分别为0.054 08、0.540 8、5.408 μg/mL 的NMP 对照品溶液，按照1.3 色谱条件连续进样6 次进行分析，试验结果见表1。由表1 可知，3 个浓度水平6 次测定峰面积的相对标准偏差为0.086%～1.332%，表明该方法的精密度良好。

表1 精密度试验结果

2.6 加标回收试验

取适量样品供试液，精密加入对照品溶液，制成低、中、高3 个浓度水平的加标供试溶液，各平行制备3 份，按1.3 色谱条件进行测定，试验结果见表2。由表2 可知，NMP 3 个浓度水平的平均回收率为93.12%～95.13%，表明该方法准确度良好，满足《中国药典》2020 版药品质量标准分析方法验证指导原则中的规定。

表2 加标回收试验结果

2.7 样品测定

选取4 套血液透析器样品，按照1.4 方法分别制备样品供试液（编号分别为1#、2#、3#、4#），采用1.3色谱条件测定样品供试液中NMP 的含量，结合样品供试液制备方法，计算NMP 临床接触量，测定结果见表3。由表3 可知，单套血液透析器样品中NMP 最大临床接触量为446.36 μg。根据GB/T 16886.17—2005 《医疗器械生物学评价第17部分：可沥滤物允许限量的建立》对血液透析器中NMP允许限量进行评估，血液透析器中NMP 的测定值在允许限量范围内［18］。