大补阴丸对糖尿病肾病小鼠肾功能改善作用研究

吴鑫宇，曲苗，宋寒冰，关子赫，张婷婷

(黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040)

糖尿病作为一种慢性代谢性疾病，发病率逐年上升，发病人群趋于年轻化。流行病学统计数据预测，全球糖尿病患病总人数将由2017年4.5亿增至2045年6.9亿[1]。随着科研及临床对糖尿病领域认识的不断深入，治疗药物不断开发并投入市场，糖尿病已不再是严重威胁患者健康的疾病[2]。但由于长期高血糖所致的大血管、小血管、微血管损伤是不可逆的，进而患者会出现心、脑、肾、眼睛、足、周围神经等并发症[3]。糖尿病肾病(DN)是糖尿病严重的微小血管并发症之一，是导致终末期肾脏病的重要诱因[4]。根据数据显示，肾脏疾病与血糖、血压有密切关系，超过80%终期肾脏疾病是由糖尿病和/或高血压引起的[5]。

随着对DN治疗手段及药物研究的不断深入，中西医以各自的理论体系在诊治DN中均发挥着重要作用。西医治疗以控制血糖血脂，改善蛋白尿为主，可很大程度上改善患者临床症状，但并未能阻止DN的发展[6]。在中医药理论的指导下，针对糖尿病阴虚为本燥热为标的病机，采用清热润燥、养阴生津之法。DN作为糖尿病常见并发症，除具有糖尿病典型症状如多食、多饮、多尿外，还兼见尿液浑浊如膏脂、腰膝酸软、乏力、耳鸣、口干唇燥、舌红苔少等症状表现。治以清热养阴、益肾固本之法，方用大补阴丸可标本兼顾。大补阴丸作为一首经典方剂，广泛用于DN治疗，文献中可见临床应用论著[7]，但未见大补阴丸治疗DN的动物实验研究报道。阿司匹林在临床中可用于治疗糖尿病肾病，该疗效得到了临床及动物实验证实[8-9]，故选用阿司匹林作为阳性对照药。本实验以自发性糖尿病(db/db)小鼠为模型动物，应用大补阴丸对其进行治疗，观察本方对DN小鼠肾功能改善作用，以期为大补阴丸治疗DN提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

C57BL/6种系野生型db/m模型小鼠，10只雄性，周龄16周；C57BL/6种系自发性糖尿病db/db模型小鼠，40只雄性，周龄16周，由牡丹江医学院提供，实验动物许可证号：SCXK(黑)2019-003。饲养于黑龙江中医药大学实验动物中心，湿度(45±5)%，于实验前适应性喂养1周，自由摄食及饮水。

1.2 药物与试剂

大补阴丸(杭州胡庆余堂药业有限公司),阿司匹林肠溶片(广东九明制药有限公司),尿蛋白酶联免疫分析试剂盒(美国R&D公司),Cys-C免疫试剂盒(湖南永和阳光科技有限公司),RBP酶联免疫试剂盒(美国R&D公司),苏木素-伊红染液(南京建成)。

1.3 仪器

全自动生化分析仪(7180),德国莱卡切片机(LEICARM 2135),显微摄影成像系统(moticam 3000),微量加样器(NICHIRYO),罗氏血糖仪及血糖试纸(批号：07124112，罗氏)。

1.4 方法

1.4.1 分组及给药

db/m小鼠10只，作为空白组；db/db小鼠40只，随机分为4组，每组10只，分别为模型组,阳性药组(阿司匹林),大补阴丸高、低剂量组。其中空白组及模型组给予生理盐水灌胃，依据人-小鼠体表面积公式，阳性药小鼠给药量为0.013 g/(kg·d)，大补阴丸成人每日服药量作为小鼠低剂量，大补阴丸低剂量组小鼠给药量为2.34 g/(kg·d)，高剂量给药量为低剂量2倍，大补阴丸高剂量组小鼠给药量为4.68 g/(kg·d)。每日1次，连续灌胃4周。

1.4.2 样本采集

分别于用药前及药物治疗2周、4周后采血。末次给药后，将小鼠分别置于代谢笼中，收集24 h尿液，置于离心管中，离心取上清液，于-20 ℃冰箱保存待测。末次给药24 h后，麻醉小鼠并摘除眼球取血，3 000 r/min离心15 min，取血清，置于-20 ℃冰箱保存待测。在冰块上解剖腹部迅速剥离左侧肾脏，去除包膜，置于4%多聚甲醛中固定。

1.4.3 标本检测

血糖测定：小鼠尾静脉取血，用血糖仪检测第0周、第2周及第4周小鼠随机血糖值，以FPG≥11.1 mmo1/L作为模型成功的判断标准[10]。

尿液检测：全自动生化分析仪检测小鼠24 h尿蛋白排泄率(UAE)、肌酐(Scr)及尿素氮(BUN)。

血清检测：免疫比浊法检测血清中胱抑素(Cys-c)；ELISA试剂盒检测血清中视黄醇结合蛋白(RBP)。

肾脏病理变化：置于4%多聚甲醛中固定，石蜡包埋，切片，进行HE染色，观察肾脏病理变化。

1.5 统计学方法

2 结果

2.1 各组小鼠治疗前后血糖数值

空白组小鼠血糖数值在正常值范围，整个实验过程血糖数值基本保持稳定，模型组小鼠血糖数值随周龄增大持续升高，数值符合糖尿病小鼠标准，此模型动物可靠。给药前空白组与其余各组比较，差异具有统计学意义(P<0.01)。模型组小鼠血糖数值持续升高，第2周各给药组血糖均下降与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。第4周各给药组血糖下降到正常范围与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.01)，见表1。

表1 各组小鼠治疗前后血糖的比较

2.2 各组小鼠尿液中UAE、Scr及BUN含量

比较各组小鼠尿液中UAE含量，与空白组相比，其他组UAE含量均有不同程度升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，各给药组与模型组相比尿液中UAE含量有所下降，差异具有统计学意义(P<0.01)。比较各组小鼠尿液中Scr含量，与空白组相比其余各组Scr含量均升高，差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)，各给药组与模型组相比尿液中Scr含量有所下降，其中低剂量组、高剂量组与模型组相比降低更明显，差异具有统计学意义(P<0.05)。比较各组小鼠尿液中BUN含量，与空白组相比其余各组BUN含量均升高，差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.01)，各给药组与模型组相比尿液中BUN含量有所下降，其中阳性药组、低剂量组与模型组相比降低更明显，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 各组小鼠尿液中UAE、Scr及BUN含量

2.3 各组小鼠血清中Cys-c、RBP含量

用免疫比浊法检测各组小鼠血清中Cys-c含量，空白组Cys-c含量最低，其余各组与空白组比较含量显著升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，各给药组与模型组相比Cys-c含量有所下降，差异具有统计学意义(P<0.01)。用ELISA试剂盒检测各组小鼠血清中RBP含量，空白组RBP含量最低，其余各组与空白组比较含量显著升高，差异具有统计学意义(P<0.01)，各给药组与模型组相比RBP含量有所下降，其中阳性药组与模型组相比差异具有统计学意义(P<0.05)，低剂量组、高剂量组与模型组相比降低更明显，差异具有统计学意义(P<0.01)。见表3。

表3 各组小鼠血清中Cys-c、RBP含量

2.4 各组小鼠肾脏病理变化

HE染色可见，空白组小鼠肾脏组织中肾小球、肾小管以及小管间质结构完整，细胞排列规整、大小正常，基底膜、系膜区均未见异常。模型组小鼠肾脏局部肾小管扩张，肾小管上皮细胞脱落、萎缩，系膜增生，基质增加，基底膜增厚，肾小球毛细血管袢模糊。与模型组相比，各给药组肾小球血管内皮细胞、系膜细胞数量明显增多，肾小球系膜间质减少，肾小球毛细血管袢较清晰，见图1。

图1 各组小鼠肾脏病理学观察(HE，400×)

3 讨论

随着高血糖状态的持续，肾脏会出现由代偿期到失代偿期的转变[11]。DN病理变化十分复杂，早期由于高糖状态使肾脏出现血流动力学变化，高滤过高灌注之下肾小球出现肥大，系膜增生，基质增加，基底膜增厚等病理变化[12]。实验末期模型组小鼠肾脏已呈现以上变化，随着疾病进一步发展，小鼠肾小球及肾小管间质会出现纤维化，使肾小球滤过及肾小管重吸收功能下降，发展为终末期肾病[13]。但是由于本实验动物周龄尚小，没有表现出晚期肾脏变化。本次实验以db/db小鼠为研究对象，该品种小鼠是由于瘦素受体基因突变而得到的，对瘦素敏感性差，不会出现饱腹感，会出现多食、多饮、多尿的表现，与人类糖尿病症状表现相似。研究证实db/db小鼠4周龄时血糖开始升高，于6周龄时出现高血糖，8周时出现蛋白尿，15周龄左右出现肾功能衰退，症状与病理变化均与临床DN相似，常作为DN的实验动物模型[14]。故本实验以具备DN特征的16周龄db/db小鼠为实验动物。

蛋白排泄率(UAE)、肌酐(Scr)及尿素氮(BUN)可反映肾脏功能，在出现肾脏功能异常的早期阶段即可表现出尿液中含量的变化，对判断DN预后和疗效有十分重要的意义。胱抑素C(Cys-c)是半胱氨酸蛋白酶抑制剂，属于小分子蛋白。循环中的Cys-c可自由通过肾小球滤过屏障，在近端肾小管上皮细胞中被完全分解，Cys-c产生速度稳定，肾脏是唯一清除Cys-c的器官，肾小球滤过率是调节Cys-c的主要方式，因此血清Cys-c是反映肾小球滤过率情况的理想同源性标志物[15-16]。视黄醇结合蛋白(RBP)是由肝脏分泌的一种小分子维生素转运蛋白，在体内主要以前蛋白、视黄醇结合的形式存在，经肾小球过滤，再由近端肾小管重新吸收、降解。当肾脏出现疾病时，血液和尿液中RBP都会升高，该变化在肾病早期即可出现[17]。

中医将糖尿病肾病归属于“消渴”范畴，在世界医学史中，中医学对本病的认识最早，且论述甚详。消渴之名首见于《素问·奇病论》，认为五脏虚弱、过食肥甘厚味、情志失调等都是引起消渴的病因，阴虚内热是其主要病机。《证治准绳·消瘅》在消渴上、中、下分类上又做了规范，即“渴而多饮为上消，消谷善饥为中消，渴而便数有膏为下消。”《临证指南医案》云：“三消一证，虽有上、中、下之分，其实不越阴亏阳亢，津涸热淫而已。”大补阴丸出自《丹溪心法》，以熟地黄滋补真阴，益精填髓；龟板滋阴潜阳，补肾健骨。两药相须，补阴固本，滋水亦可制火，共为君药。知母、黄柏可清降阴虚之火，共为臣药。全方滋阴培本为主，降火清源为辅，实乃补泻并施之方[18]。本课题组在临床实践基础上[19]，提出针对DN阴虚为本燥热为标的病机，应用大补阴丸进行干预。研究结果显示，大补阴丸能够平稳地降低db/db小鼠血糖，降低尿液中UAE、Scr及BUN含量，降低血清中Cys-c、RBP含量，HE染色观察肾脏病理变化，可见大补阴丸组小鼠肾脏结构异常表现不严重。但本实验也存在一些不足之处，一是治疗机理应进一步探究阐释；二是治疗时间应适当延长，验证该药远期疗效，观察小鼠各项生理指标是否可恢复到正常范围。

综上所述，大补阴丸对db/db小鼠模型出现的DN具有良好的治疗作用，为大补阴丸治疗DN奠定了实验基础。