松萝提取物对CIA大鼠HMGB1介导的炎症因子表达的影响

雷玉梅,安阳,张军,徐晖,陆道敏,曹跃朋,宁乔怡,王莹

(1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550025；2.贵州中医药大学第二附属医院，贵州 贵阳 550002)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以关节滑膜炎为主要病理特征的慢性疾病，滑膜炎是RA病情发展致残的重要因素。

高迁移率族蛋白B1(High mobility group protein,HMGB1)是近年来发现的一种促炎中介，它可诱导及参与炎症的发生与发展，在自身免疫性疾病中可能具有十分重要的作用。研究证实，HMGB1在类风湿关节炎患者血清、滑膜液中存在且异常增高[1-2]；HMGB在RA炎症的持续过程中发挥着重要作用。HMGB与TLR2、TLR4受体结合，诱导TNF-α、IL-1β等致炎因子释放[3-4]导致炎症持续,造成关节破坏，这些炎性因子又能促进HMGB1的释放[5]，以此形成一个正向炎症反馈通路。

侗医药松萝具有祛风除湿、通络止痛的功效。经课题组前期研究证实松萝提取物对RA的治疗具有良好疗效[6]。经动物实验证实松萝能缓解CIA模型大鼠的关节肿胀情况并能抑制NF-κB的蛋白活性[7-8]。因此，在前期研究的基础上，本研究提出HMGB1介导的细胞炎症是RA患者关节滑膜炎症发生、发展的关键因素，侗医“赶邪、消水”理论指导下的侗族药松萝提取物可能通过调控HMGB1介导的炎症反应，抑制RA关节滑膜炎症的科学假说，具有充分的理论依据和坚实的前期研究基础。为验证此假说，本研究从动物实验探讨松萝提取物通过HMGB1炎症通路调控RA炎症因子的分子机制。

1 实验材料与方法

1.1 实验器材及试剂

仪器：全自动酶标仪(Thermo scientific，Multiskan MK3)，PCR仪(东胜创新生物科技有限公司，EDC-810)，垂直电泳槽(北京六一仪器厂，DYCZ-40)等。试剂：磷酸酶抑制剂(碧云天，S1873)，BCA蛋白浓度测定试剂盒(碧云天，P0010)，RIPA裂解液(碧云天，P0013B)等。

1.2 实验方法

1.2.1 动物及分组

SPF级5周龄Wistar雌性大鼠54只，体质量150～180 g,购自湖北省实验动物研究中心，动物合格证号:SCXK(鄂)2020-0018，喂养环境室温20～25 ℃、湿度70%左右，自由进食、自由饮水，适应环境1周后开始试验。按随机数字表进行编号，随机分为松萝提取物低、中、高剂量组和羟氯喹组、空白组、模型组[1]，每组9只。

1.2.2 模型的制备

将Ⅱ型胶原溶于0.1 mol/L的醋酸中，搅拌溶解，配制成2 mg/mL溶液，置4 ℃冰箱过夜。与弗氏完全佐剂等体积混合，乳化配制成Ⅱ型胶原乳剂，分别于大鼠尾根部多点皮内注射0.1 mL致炎，复制稳定的CIA大鼠模型[9]。造模成功评价：采用关节炎评分法，即造模成功的大鼠趾端至踝关节段红肿，关节炎症评分>4分[10]。

1.2.3 给药剂量

根据课题组前期的药代动力学研究结果，本研究的给药剂量为松萝提取物6 mg/kg为中剂量，其1/3剂量(2 mg/kg)为低剂量，9倍剂量(54 mg/kg)定为高剂量。羟氯喹成人用量400 mg/日，参照60 kg成人与动物药物剂量换算系数表，大鼠用药剂量(mg/kg)=5.4×人用药剂量(mg/kg)[11]。

1.2.4 样品采集

末次灌胃2 h后，以乌拉坦按0.4 mL/100 g的剂量，经腹腔注射麻醉后，股动脉取血4～6 mL，室温静置30 min后3 000 r/min离心15 min，提取血清。处死大鼠后，取大鼠后右足踝关节，取出滑膜组织，提取组织蛋白。

1.2.5 ELISA法检测血清致炎因子

ELISA法检测IL-23、IL-6、IL-1β、TNF-α的分泌。按照试剂盒设空白孔、标准孔、待测样品孔,分别加样，36 ℃孵育90 min，洗板5次，加入酶标试剂，36 ℃反应，温育1 h，洗板5次，加入TMB 100 μL，覆膜36 ℃避光，温育15 min，后加入终止液，测量OD值，进行计算。

1.2.6 HMGB1、TLR4与TLR2 mRNA表达检测

采用PCR法检测TLR2、TLR4与HMGB1表达量。提取总RNA,逆转录合成cDNA，反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min；95 ℃ 30 sec，60 ℃30 sec，40 cycles。引物设计如下，β-actin：(F)5’- CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC -3’，(R) 5’- TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT -3’;TLR2:(F)5’-GGAAGCAGGTGACAACCATT-3’,(R)5’-CGCCTAAGAGCAGGATCAAC-3’;TLR4:(F)5’-TGGTGGCTGTGGAGACAAAAATGAC-3’(R)5’- CTGAAAGGCTTGGGCTTGAATGGAG-3；每个样本3个副孔，重复3次。

1.2.7 Western Blot法检测HMGB1、TLR2与TLR4蛋白表达量

将少量剪碎的组织块置于2 mL EP管中，加入洗净的钢珠，裂解、匀浆，置于冰上30 min。用移液器将裂解液移至1.5 mL离心管中在4 ℃下12 000 r/min离心5 min，取上清分装于0.5 mL离心管。以BSA为标准，进行蛋白浓度测定。沸水浴10 min将蛋白变性。10% SDS-PVDF电泳，各样品总蛋白量为40 μg。加样后先恒压80 V电泳至溴酚蓝指示剂在浓缩胶与分离胶交界处成线状，改为恒压120 V至溴酚蓝到凝胶底部，此过程约用时1.5 h。封闭2 h。一抗4 ℃过夜，二抗孵育2 h。将ECL试剂中增强液与稳定的过氧化物酶溶液按1∶1比例混匀，滴加工作液于PVDF膜上，反应数分钟待荧光带明显后，用滤纸吸去多余的底物液，覆上保鲜膜，X光胶片压片后依次放入显影液显影、定影液定影，冲洗胶片，晾干胶片，扫描胶片，用BandScan分析胶片灰度值。

1.3 数据分析

2 结果

2.1 松萝提取物对CIA大鼠血清中HMGB1含量的影响

与空白组比较，松萝提取物低剂量组、中剂量组、高剂量组、羟氯喹组及模型组的HMGB1含量均增高(P<0.05)，与模型组相比较,不同浓度的松萝提取物、羟氯喹组均可降低HMGB1含量(P<0.05)；松萝中剂量组、高剂量组与羟氯喹组相比降低HMGB1的效果相当，无显著差异，见表1。

表1 松萝提取物对CIA大鼠血清中HMGB1含量的影响

2.2 松萝提取物对CIA大鼠血清中IL-1β、TNF-α、IL-23与IL-6含量的影响

与空白组比较，松萝提取物低剂量组、中剂量组、高剂量组、模型组、羟氯喹组的IL-1β、IL-6、IL-23、TNF-α含量均增加(P<0.05)；与模型组比较，松萝提取物中剂量组、高剂量组及羟氯喹组均能降低TNF-α、IL-23、IL-1β、IL-6含量(P<0.05)，松萝中剂量组、高剂量组与羟氯喹组相比，差异无统计学意义，见表2。

表2 松萝提取物对CIA大鼠血清中IL-6、IL-23、IL-1β、TNF-α含量的影响

2.3 RT-PCR法检测CIA大鼠滑膜组织中HMGB1、TLR4与TLR2 mRNA的表达

与空白组相比较，松萝提取物低、中、高剂量组与模型组、羟氯喹组HMGB1、TLR4、TLR2 mRNA表达均增加(P<0.05)；与模型组相比较，松萝提取物中、高剂量组及羟氯喹组均能抑制 mRNA表达(P<0.05)；与羟氯喹组相比较松萝提取物中、高剂量组抑制HMGB1、TLR4、TLR2表达的效果相当，见表3。

表3 松萝提取物对CIA大鼠滑膜组织中HMGB1、TLR2、TLR4 mRNA表达的影响

2.4 Western Blot法检测CIA大鼠滑膜组织中HMGB1、TLR2与TLR4蛋白的表达量

与空白组相比较，松萝提取物低、中、高剂量、模型组、羟氯喹组表达均增加(P<0.05)；与模型组相比较，松萝提取物中剂量组、高剂量、羟氯喹组均能抑制HMGB1、TLR4、TLR2表达(P<0.05)；与羟氯喹相比较，松萝中剂量组、高剂量组在抑制蛋白表达上无显著差异,见图1，表4。

图1 各组CIA大鼠滑膜组织HMGB1、TLR2与TLR4蛋白表达条带图

表4 松萝提取物对CIA大鼠滑膜组织中HMGB1、TLR2、TLR4蛋白表达的影响

3 讨论

RA是一种自身免疫性疾病，发病因素复杂，其中滑膜炎症是其主要病理表现。当人体出现刺激或免疫损伤的情况下，HMGB1作为促炎因子从细胞核内释放，通过与RAGE、TLR2及TLR4受体结合，促进IL-6、IL-23等的分泌，诱导TNF-α、IL-1β等致炎因子释放[3-4]，这些炎症因子又可以反过来促进HMGB1 的释放而形成持续的炎症反应。有研究[13]发现 RA 患者与健康人相比较，血清中 HMGB1含量明显升高，活动期的RA患者与非活动期RA患者相比较，血清中HMGB1水平增高，提示HMGB1可能与疾病活动相关。动物实验发现将重组HMGB1蛋白注射进大鼠关节腔可引起滑膜炎，给CIA大鼠模型注射HMGB1抗体干预后，滑膜炎症减轻[1]。TLR属于跨膜蛋白，是HMGB1的特异性受体，在炎症信号传递中有着重要作用。研究发现，HMGB1可被TLRs识别，参与免疫应答过程[14]。在小鼠或者大鼠关节腔内注射TLR配体如细菌DNA，LPS等可诱导关节炎症的发生，LPS与Ⅱ型胶原联合进行关节腔内注射可加重关节炎症反应，而敲除TLR2、TLR4的动物表现出炎症程度明显下降。IL-6、IL-23、TNF-α、IL-1β是RA病程中的主要促炎因子[15-16]。HMGB1可以通过激活NF-κB信号通路诱导炎症因子的释放。本研究证实，松萝提取物具有较好的抗炎作用。中剂量及高剂量组的松萝提取物可有效减轻CIA大鼠血清中IL-1β、IL-6、IL-23、TNF-α、HMGB1的浓度，以及滑膜细胞中 HMGB1、TLR2、TLR4蛋白表达。

综上所述，松萝提取物能降低HMGB1、TLR2、TLR4 mRNA的表达量，并抑制HMGB1、TLR2、TLR4的蛋白表达，减少IL-6等细胞因子的含量，阻断HMGB1/TLR炎症通路，从而减轻RA滑膜炎症，达到控制关节炎的目的。