Keap1-Nrf2 信号通路在机体氧化应激损伤防护中的研究进展

梁新妹 王云平 李 丹 王文婧 穆欣颜 韩清臣 李 博 张立双

天津市滨海新区中医医院检验科，天津 300451

Kelch 样环氧氯丙烷相关蛋白1（Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1，Keap1）-核转录因子E2 相关因子2（nuclear transcription factor E2-related factor 2，Nrf2）介导氧化还原反应体系，是机体内源性抗氧化信号通路重要的组成部分[1]。Keap1-Nrf2 信号通路的激活可调控机体内一些抗氧化酶和蛋白质的表达和转录，并参与炎症、癌症、脑缺血性疾病、糖尿病等发病过程。因此，该通路在多种氧化应激导致的疾病中扮演着重要角色[2]。本文从该通路的基本结构与氧化应激[Nrf2、Keap1、抗氧化反应元件（antioxidant responsive element，ARE）的结构及氧化应激反应的关系）]、调控机制（Nrf2 与Keap1 的解偶联、Nrf2 磷酸化作用、Nrf2 的降解减弱机制、门闩和枢纽学说等机制）及与各种疾病的关系等方面展开综述。

1 Kelch-Nrf2 通路与氧化应激反应

氧化应激是一种外界刺激导致的机体内氧化/抗氧化动态平衡失衡，进而导致机体的应激反应。正常状态下，参与活性氧（reactive oxygen species，ROS）产生的系统和清除系统处于动态平衡。外界环境的刺激或机体自身的稳态变化等原因，使机体内的ROS产生增多或机体对ROS 的清除能力下降，会出现氧化应激[3]。长期处于氧化应激这种异常状态，会使机体处于易损状态，致病因素对集体的毒性作用会明显增强，可导致基因突变[3]。

ROS 是一类氧的单电子还原产物，包括超氧自由基和羟基自由基，以及非自由基分子如过氧化氢等。其中一部分物质如超氧化物或羟基自由基，极不稳定；而另一部分物质，如过氧化氢，则可自由扩散，寿命相对较长。目前认为ROS 主要由线粒体内的ETC 膜电子传递链和氧分子之间的非特异性反应所生成[4]。

在生物体，有大量含氧分子的氧化电位，ROS是其中的一种，其余还有包括单O2、超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基和活性氮、过氧亚硝基阴离子、二氧化氮和三氧化二氮。其都是强有力的氧化剂，可以由细胞（吞噬细胞或上皮细胞等）的正常代谢产生；也可以由外源因素诱导产生。在细胞中，ROS 积累和活性氮增加蛋白质的氧化修饰，对蛋白质的羰基含量和改性的残基或硝基发生氧化均有影响，生成氢过氧化物脂质、脂质衍生物及嘌呤和嘧啶，诱导DNA 聚合与断裂，通过对大分子物质的氧化攻击，导致蛋白质、膜、核酸的功能障碍[5]。ROS 过度积累，并且浓度持续较高，极易与核酸、蛋白质、脂质等生物大分子物质产生氧化反应，细胞的结构和功能发生损害，引发疾病[6]。

2 Keap1-Nrf2-ARE 的结构

2.1 Keap1 的基本结构

Keap1 是一种69 kD 的蛋白，负调控Nrf2。Keap1包含627 个氨基酸残基，共分为5 个区域。①NTR 区，N 端域。②BTB 区，负责同源二聚化Cul3 与Nrf2 泛素化过程，与介导Keap1-Nrf2 结合有关，其核心位点Ser-104 突变会影响Keap1 二聚化，干扰Nrf2 的结合[6]。③IVR 区，连接BTB 与DGR 的区域。该区富含半胱氨酸，Keap1 与ROS 及亲电试剂的反应都发生在IVR区，两个反应性半胱氨酸残基Cys273 和Cys288 对调节E3 连接酶活性至关重要，因此与Nrf2 稳定性有关，是Nrf2 降解的关键。④C 末端DGR 区，Kelch 领域区拥有多个蛋白接触位点，介导Keap1 与Nrf2 和细胞骨架等蛋白的关联[6]。⑤CTR、DGR 和CTR 一起被称为Keap1-DC，对Nrf2 的Neh2 结构域的结合至关重要[7]。

2.2 Nrf2 的基本结构

Nrf2 属于转录因子家族中的一个小家族，存在于机体的各个组织器官中[7]。Nrf2 可诱导一组抗氧化和解毒酶基因，在保护机体免受各种环境刺激等方面起着关键作用。

Nrf2 分为7 个Nrf2-ECH 同源结构域（Nrf2-ECH homology domains，Neh），这些区域在不同物种间高度保守。Neh1 区包含介导DNA 结合和二聚体形成的CNC 和bZIP 构域，有利于Nrf2 与DNA 的结合，调控目标基因和下游酶的表达。Neh2 区包含两个绑定基序DLG 和ETGE，能够与Keap1 的DGR 区结合，使Nrf2 被锚定于细胞质中，从而抑制其活性[8]。Neh3，Neh4 和Neh5 是反式激活区域，Neh3 区是Nrf2 基因转录必不可少的功能区域[9]。Neh4 和Neh5 是存在于Neh1 和Neh2 之间的两个激活区，可协同促进Nrf2 转录，结合RAC3/AIB1/SRC-3，增加Nrf2-ARE 基因表达[10]。Nrf2 进入细胞核与ARE 结合后，需要在Neh4、Neh5 与共激活因子cAMP 反应元件结合蛋白相互作用下，启动转录。Neh6 区是Nrf2 降解调控区域，该区域与Nrf2 的负性调节有关[11]。Nrf2 的缺失或激活障碍，会增加细胞对外界刺激的敏感性，与多种疾病密切相关[10]。

2.3 ARE 的基本结构

ARE 是一种重要的抗氧化应激损伤顺式反应元件[12]，位于某些细胞保护基因的上游启动子区域，编码许多解毒酶和细胞保护蛋白基因，又称亲电反应元件。ARE 具有典型的活性功能，其核心序列为5’-（G/A）TGA（G/C）nnnGC（G/A）-3’（n 为任意核苷酸）。氧化应激时，Nrf2 与Maf 形成异二聚体，识别并结合到ARE上，从而激活Nrf2-ARE 信号通路[13]。

3 Keap1-Nrf2-ARE 信号通路的调控机制

Keap1 是氧化还原损伤的传感器，富含半胱氨酸硫醇；而Nrf2 是调节细胞保护基因。Keap1-Nrf2 系统广泛参与细胞的增殖和分化，在细胞保护等方面起到至关重要的作用[12-13]。

3.1 Nrf2 与Keap1 解偶联

生理状态下，Keap1 与Nrf2 相结合，在细胞质内形成Keap1-Nrf2 异二聚体。应激状态下，其是Keap1的IVR 结构与亲电试剂或ROS 起反应的传感蛋白，同时也是细胞内氧化还原的感应器。ROS 亲电子物质通过影响细胞内的氧化还原状态导致Keap1 的IVR结构域中的半胱氨酸残基（Cys273、Cys288）被修饰，从而使Keap1 构象改变[14]，失去对Nrf2 负性调节功能，Nrf2 与Keap1 发生解偶联后，Nrf2 不再被泛素蛋白酶体降解[15]，激活的Nrf2 调控下游靶基因转录[16]。

3.2 Nrf2 磷酸化作用

Nrf2 的磷酸化使Nrf2 的degron 结构区域的构象发生改变，阻碍了E3 泛素化连接酶识别degron 结构，激活Nrf2 固有的转录活性[17]。研究发现，PKC 可引起Nrf2 的Ser-40 位点磷酸化[18]，同时该种磷酸化修饰还能够进一步降低Nrf2 与Keap1 的亲和力[19]。

3.3 Keap1 介导的泛素化与蛋白酶对Nrf2 的降解减弱机制

研究证实，Keap1 能促进Nrf2 泛素化，而Nrf2 稳定性和活性受蛋白酶调节[20]。Nrf2 通过Neh2 区中的两个基序：高亲和力ETGE 和低亲和力DLG 基序与Keap1 直接相互作用。在非胁迫条件下，ETGE 和DLG 基序之间的7 个泛素化靶点赖氨酸残基被含有Keap1 的E3 泛素连接酶泛素化，随后通过蛋白酶体途径降解。Nrf2 的降解减弱还受到亚细胞定位、转录后修饰等调控[21-22]。

3.4 门闩和枢纽学说

Keap1 二聚体的两个DGR 区分别与Nrf2 的DLG、ETGE 两个基序通过疏水作用和氢键相结合，介导降解Nrf2 的泛素化。ROS 刺激后，会从DGR 区解离低亲和力的DLG 区，泛素化降解Nrf2。Keap1 的位点处于饱和状态，在ARE 介导下，促进下游靶基因的表达[15]。

4 Keap1-Nrf2 信号通路与疾病的关系

Nrf2 活性及其调节机制对维持健康至关重要，Keap1-Nrf2 参与了多种疾病的发生和发展[3,23-24]，该通路已成为预防和治疗氧化应激相关疾病的一个重要靶点。

4.1 Keap1-Nrf2 信号通路与炎症的关系

当内源性应激防御机制失衡时，Keap1-Nef2 的信号通路可保护细胞面对氧化损伤。Nrf2 基因经腺病毒传递至大鼠心室心肌细胞后，Nrf2 在胞质和核内均有高水平的表达。Nrf2 的过表达增加了几种依赖于ARE 的抗氧化和细胞保护酶的表达[25]。在炎症损伤早期，Nrf2-ARE 可能抑制促炎介质的表达[23,26]。芍药汤通过对Keap1-Nrf2 通路的调控作用，减弱了肠炎癌变小鼠模型[27]。同时，土茯苓对肝纤维化动物的炎症消减作用也与Keap1-Nrf2 通路相关[28]。因此，通过激活Nrf2-ARE 系统对机体保护炎症组织损伤起到至关重要的作用[26]。

4.2 Keap1-Nrf2 信号通路与肿瘤的关系

Nrf2 在细胞质中与Keap1 结合，处于稳定状态，当受到氧化应激或亲电试剂刺激时，Nrf2 与Keap1 解偶联，与ARE 结合并激活下游抗氧化基因转录和表达，提高细胞氧化应激及修复功能[29]。通过促进Nrf2 核异位，诱导相关保护蛋白抵抗正常细胞发生恶变的能力[30]。Nrf2 可通过激活抗氧化应激通路保护细胞免受DNA 破坏性侵害，从而抑制肿瘤的发生。一旦通过获得一个或几个致癌突变来转化细胞，则会促进肿瘤的形成。Keap1、Nrf2 和CUL3 基因的突变可破坏Nrf2和Keap1 之间的相互作用，导致肿瘤细胞中Nrf2 信号的本构性激活，具有高水平Nrf2 活性的肿瘤细胞会通过新陈代谢重新编程来促进癌细胞的侵袭性增殖[31]，以及对抗癌治疗的抵抗[32-33]。

4.3 Keap1-Nrf2 信号通路与脑缺血的关系

脑是代谢率最高的器官，脑内正常存在抗氧化酶可清除ROS[34]。在脑缺血过程中，脑内生成乳酸，可大量生成ROS，原因如下：①游离Fe2+浓度升高；②O2·-转化生成过氧化氢的速率提高。再灌注时，线粒体膜电位超极化可增加电子漏发生率，促使ROS 增长[35-37]。另外，再灌注时次黄嘌呤转变为黄嘌呤，释放大量电子，生成大量ROS。在CIRI 过程中，由于消耗抗氧化物，脑内清除ROS 的能力下降，引起氧化应激[38]。活化Keap1-Nrf2 通路可以清除ROS，保护神经元。

4.4 Keap1-Nrf2 信号通路与糖尿病的关系

糖尿病是一种常见的代谢性疾病。氧化应激的增加可能激活多种应激激酶，如c-Jun 氨基末端激酶通过胰岛素受体底物1 的丝氨酸磷酸化，破坏胰岛素信号级联，导致胰岛素抵抗。Nrf2 介导的内源性抗氧剂的表达已被认为是机体防御高血糖诱导的糖尿病氧化损伤的重要适应性防御机制[39-40]。

一方面，高糖可诱导线粒体内的电子传递呼吸链产生大量的超氧化物，造成机体和细胞氧化应激；另一方面，氧化应激损伤可通过活化其敏感性信号通路引起胰岛素抵抗[41]。牛磺酸能够通过诱导Nrf2 核异位，使ROS 生成减少，从而减轻氧化应激诱导的胰岛素抵抗[42]。Keap1-Nrf2-ARE 信号通路通过促进Nrf2核异位并与ARE 结合，改善氧化应激诱导的细胞胰岛素抵抗。

Nrf2 可保护胰岛β 细胞免受各种类型的损伤，包括与氧化剂、有毒化学物质和炎症相关的损伤。Nrf2信号的激活通过促进AMPK 磷酸化、耗氧量和葡萄糖摄取、抑制糖异生和体重增加来抑制胰岛素抵抗的发生。Keap1、Nrf2 因子及Keap1-Nrf2 信号通路在糖尿病的发生、发展过程中可对抗氧化应激，从而保护胰岛β 细胞[43]。

5 结语

综上所述，氧化应激不仅可以引起细胞结构损伤，同时与临床上许多疾病有一定的相关性。Keap1-Nrf2信号通路能够激活细胞对各种氧化应激的适应性反应，使细胞通过诱导多种编码调节下游抗氧化基因和Ⅱ相解毒酶的表达来抵御有害刺激，平衡细胞内氧化还原状态，降低氧化应激损伤。多种疾病的发生均与氧化应激损伤有关，Keap1-Nrf2 信号通路在许多疾病中的调控十分精细、复杂。临床上，替拉格司他通过靶向该通路已经成为治疗非小细胞肺癌的新靶向药；抑制剂Sapanisertib 已获得FDA 的批注，开展临床研究。同时也应当注意到，针对该通路的研究主要是基于细胞层面和动物模型层面上，临床上针对该通路靶点的药物多数还在临床试验委托合同研究验证阶段，走向临床还需要一段距离。但是我们相信，在不断发展的生物医学技术面前，以Keap1-Nrf2 信号通路作为靶点的新一代生物医药会为人类的健康带来福音。