浙江省羊肉样品中10种喹诺酮类药物残留检测及风险评估

王小骊，杨华，汪建妹，童喻浩，廖琳慧，肖英平，吉小凤*

(1.浙江省农业科学院 农产品质量安全与营养研究所，浙江 杭州 310021；2.湖州市梅溪镇人民政府便民服务中心，浙江 湖州 313307；3.丽水市莲都区农业技术推广中心，浙江 丽水 323000)

随着居民生活水平的提高，对于肉食品的种类及产量的需求逐渐增长，特别是羊肉呈供应紧张的态势。统计数据显示，2015年我国羊肉产量为441万t[1]。《全国草食畜牧业发展规划(2016—2020年)》中提出，“十三五”时期草食畜牧业发展目标是在2020年羊肉产量达500万t[1]。肉羊产业已成为改善居民膳食结构的重要产业。随着养殖业的发展和壮大，越来越多的兽药应用于生产中，其使用时间几乎贯穿动物饲养的全过程。近年来动物滥用抗生素的危害，正在迅速向人类传导，动物性食品的食用安全已成为人们关注的健康问题。

喹诺酮类药物是一类广谱抗菌药物，在临床应用中具有良好的抑菌及杀菌作用。常见的喹诺酮类药物有环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、沙拉沙星、诺氟沙星等，具有抗菌谱广、抗菌力强、组织穿透力强、给药方便、价格低廉等特点。该类药物在兽医临床感染性疾病的治疗和预防上应用越来越广泛[2]，但由于药物滥用，导致其在动物上出现毒性反应，并存在残留危害，使致病菌产生耐药性，而且对人体也会产生不良反应[3]。

近年来，全国各地监测中，羊肉样品不断有喹诺酮类药物残留检出。参照GB 31650—2019[4]规定，羊肉中恩诺沙星残留限量标准值为≤100 μg·kg-1。2020年9月，山东龙口市一家餐饮管理有限公司销售的生羊肉中恩诺沙星检出值为748 μg·kg-1，超标7倍多[5]；2016年1月，国家食药监总局公布新一期的食品抽检信息，其中3批次由宁夏中莹牧业有限公司生产的羊后腿肉检出值为5 782 μg·kg-1，恩诺沙星超标57倍[6]。2020年10月，上海市一家鲜肉经营部羊腿中恩诺沙星检出值为1 520 μg·kg-1，超标15倍，其羊排中的检出值为30 800 μg·kg-1，超标308倍[7]。上述产品均不符合国家食品安全规定。据报道，恩诺沙星虽不具有致癌性及畸胎反应，急性毒性低，但大剂量恩诺沙星对人及动物都具有一定的毒性，其副作用包括肠道障碍、高致敏感性反应及结晶尿[8]。由于恩诺沙星属于人畜供用药，人群若长期摄入含有微量恩诺沙星药物残留的动物源性食品，有可能导致细菌产生耐药性[9]。

浙江省有充足的草地面积和经济作物副产物，适于饲养羊等草食动物。羊养殖过程中，因饲养者对兽药使用方法和性能缺乏了解，对兽药残留危害认识不足，可能存在饲养单位未按农业农村部规定要求执行动物屠宰休药期规定，或发病食品动物大剂量、长时间使用抗生素，导致动物体内药物残留过多，影响到动物产品质量安全风险。目前网络报道羊肉样品中喹诺酮类药物检出情况较多，但有关羊肉中药物残留风险监测与风险评估的研究并不多[10]。本研究利用浙江省内生产环节和流动环节随机采集的120批次羊肉样品作为样本，结合我国居民不同性别和年龄组肉类消费量及平均体重，分析羊肉样品中喹诺酮类药物残留水平，评估膳食暴露风险水平，为引导消费和科学监管提供相关参考数据和信息。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

采用随机抽样方法，在浙江省内各地市的屠宰场、养殖场、农贸市场、批发市场、超市共采集羊肉样品120批次。样品的采集按照农业部畜禽产品抽样标准[11]进行，所采集羊肉样品均为羊腿肌肉部位，绞碎均质后，置于-20 ℃冷冻待测。标准品恩诺沙星、环丙沙星、沙拉沙星、洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、佛洛沙星、司氟沙星、达氟沙星的纯度均大于98.0%(德国Dr.Ehrenstorfer公司)；乙腈色谱纯(德国默克公司)；甲酸铵分析纯(上海凌峰化学试剂有限公司)；甲酸和乙酸(纯度99.0%，美国ACS恩科化学)；所用水为超纯；OasisPRiME HLB固相萃取小柱(6 mL，200 mg)，美国Waters 公司。

1.2 仪器与设备

AB SciexQTRAP 6500超高效液相色谱串联质谱仪(UPLC-MS/MS，美国AB SCIEX公司)；T25匀浆机(德国IKA公司)；EOFO-945616(涡旋仪，美国Talboys公司)；BiofugePrimoR离心机(德国ThermoFisher公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理方法

称取1.0 g样品于50 mL离心管中，加入5 mL乙腈(含体积分数0.1%乙酸)，涡旋1 min，超声20 min，8 500 r·min-1离心3 min，取上清液2.5 mL，加入固相小柱内(OasisPRiME HLB)，无需活化，收集流出液，涡旋30 s，取1 mL过0.22 μm滤膜，上机检测。

1.3.2 色谱条件

Waters ACQUITY UPLC BEH C18保护柱(2.1 mm×5 mm，1.7 μm)和色谱柱(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，柱温40 ℃，样品温度25 ℃，进样体积5 μL，流速0.3 mL·min-1，流动相为0.1%甲酸溶液+2 mmol·L-1甲酸铵水溶液(A)和甲醇(B)。

梯度洗脱程序。0～1.0 min，95% B；1.0～3.0 min，95%～80% B；3.0～7.5 min，80%～5% B；7.5～10.0 min，5% B；10.0～10.1 min，5%～95% B；10.1～12.0 min，95% B。

1.3.3 质谱条件

电喷雾离子源(ESI)，正离子扫描模式，多反应检测(MRM)模式，气帘气和碰撞气均为氮气，离子喷雾电压5 500 V，离子源温度500 ℃，雾化温度300 ℃。以一级全扫描质谱图中的喹诺酮类药物准分子离子作为各自的母离子，对其进行碰撞诱导解离，以峰度较强的二级碎片离子作为各自的定量离子，以上述离子反应进行定量分析，具有较高的专属性。

1.4 风险评估方法

本研究根据国际食品法典委员会制定的食品中污染物危害性点评估的概念与步骤，用风险商(HQ)评价羊肉产品的安全状态[12]。

(1)

式中：EDI为每日摄入量的估计值[μg·(kg·d)-1]；C为食物中的平均残留值(μg·kg-1)；F为食物的消费量(以肉类消费量计算，kg·d-1)；bw为体重(kg)。

(2)

式中：ADI为每日允许摄入量[μg·(kg·d)-1]；HQ<1表示风险可接受，值越小则风险越小；HQ>1表示有不可接受的风险，值越大则风险越大。

风险评估中肉类消费数据和不同人群的平均体重数据来源于第四次中国总膳食研究[13]。

1.5 数据处理

用Excel 2010对试验数据进行分析，结果用“平均值±标准差”标识。食品中低水平污染物可信评价中对未检出数据处理原则：未检出数据的比例高于60%时，所有未检出数据用检出限(LOD)替代；未检出数据比例不大于60%时，所有未检出数据用1/2 LOD替代[14]。

2 结果与分析

2.1 方法验证

本研究采用超高效液相色谱-串联质谱(UHPLC-MS/MS)多反应监测模式实现对10种喹诺酮类药物同时检测，检测参数质谱参数详见表1。

表1 10种喹诺酮类药物质谱参数

本研究建立固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱测定羊肉样品中10种喹诺酮类药物残留的检测方法，并对该方法的线性、灵敏度、回收率及基质效应等进行验证。表2显示，10种喹诺酮类药物在2.0～100 μg·L-1呈线性，R2均大于0.99；不同浓度加标回收试验所得回收率为70.4%～83.8%，相对标准偏差均<9.4%。超高效液相色谱-质谱联用技术具有强大的定性和定量检测能力，但质谱分析过程可能会发生离子抑制或离子增强现象，从而影响所分析化合物的准确定量，因此，基质效应已成为影响高效液相色谱质谱联用法准确定量的因素之一。本研究中，基质效应为0.4～0.6，表明基质效应影响可以接受。10种喹诺酮类药物在该方法中最低检出限(3×信噪比)和定量限(10×信噪比)分别为1.0和3.0 μg·kg-1。方法验证结果表明，方法具有良好的准确性和特异性，准确可靠。

表2 羊肉样品中喹诺酮类药物残留检测方法验证结果

2.2 羊肉中喹诺酮类药物残留分析

采用固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱对浙江省采集的120批次羊肉样品进行10种喹诺酮类药物筛查。表3显示，120批次羊肉样品中共检出4批次，检出率为3.3%，均未超过国家规定的羊肉中恩诺沙星残留最高限量值，样品合格率为100%。对羊肉样品中10种喹诺酮类药物残留筛查分析显示，只有恩诺沙星残留检出，其他9种均未检出，恩诺沙星残留浓度为3.4～4.3 μg·kg-1。食品安全国家标准规定，恩诺沙星可用于牛、羊、猪、兔、禽等食用畜禽及其他动物，在牛、禽和其他动物的肌肉中的最高残留限量值为100 μg·kg-1。

表3 羊肉中喹诺酮类药物残留检出结果

2.3 羊肉中喹诺酮类药物膳食暴露评估分析

本研究以《第四次中国总膳食研究》中10个性别年龄组肉类消费量及平均体重为参考值，评估羊肉样品中恩诺沙星药物慢性膳食摄入风险。膳食评估方法中，点评估为最常用且最便捷的暴露评估方法[12]。结合我国不同人群膳食摄入数据、平均体重和羊肉样品中恩诺沙星残留平均浓度(0.79 μg·kg-1)，计算得出人群每日摄入量估计值。恩诺沙星每日允许摄入量为6.2 μg·(kg·d)-1。表4评估显示，EDIs和HQ的范围远<1，表明浙江省内抽取的羊肉样品中恩诺沙星残留的慢性膳食摄入风险处于可控水平，未对人体健康构成危害。

表4 羊肉样品中恩诺沙星药物残留慢性膳食摄入风险评估

3 小结与讨论

本研究利用改进的固相萃取前处理方法，并结合超高效液相色谱-串联质谱法分析羊肉中10种喹诺酮类药物残留，试验结果表明，羊肉样品中恩诺沙星药物残留有检出，但未超过国家的最高残留限量标准(GB 31650—2019)，其他喹诺酮类药物如沙拉沙星、洛美沙星、培氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、氟罗沙星、司帕沙星、达氟沙星均未检出。目前研究中，禽产品和水产品中喹诺酮类药物残留检出较多[15-16]，而牛羊肉产品中喹诺酮类药物分析的较少。刘钢等[17]分析了石河子屠宰牛羊组织中兽药残留，抽查的30批次羊肝中均未检出喹诺酮类药物残留；向俊等[18]分析了湖南省各地区畜禽肉中磺胺类药物残留情况，共抽检羊肉样品40批次，其中3批次检出磺胺类药物，检出率为7.5%；张巍等[17]共采集100批次样品，筛查的环丙沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、达氟沙星等药物，均未检出；贝亦江[18]报道水产品中嗯诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、培氟沙星、洛美沙星等6种喹诺酮类药物残留检出率为0～24.2%，残留量范围为0～964.0 μg·kg-1。

食品安全风险评估分析就是对食品中有害人体健康的因素进行评估。根据评估的风险程度确定相应的风险管理措施来降低或控制影响食品安全的风险因素[19]。通过对羊肉样品中检出频率高的恩诺沙星药物开展膳食暴露风险评估表明，人体通过摄入含有恩诺沙星药物残留的羊肉，膳食暴露风险商远<1，其安全状态在可接受范围内。膳食暴露风险评估结论为浙江省内羊肉中喹诺酮类药物残留不会对人体造成危害效应，安全状态可以接受，可以放心使用。从试验结果来看，相关部门不必进行风险管理程序。前期研究中，王淑等[20]报道，通过2019—2020年采样检测分析羊肉中特布他林等9种主要β-受体激动剂，表明连续2 a抽取的140批次羊肉中，9种β-受体激动剂均未检出，羊肉产品中不存在9种β-受体激动剂残留的风险隐患，对食品安全没有影响。

本研究中计算恩诺沙星药物残留暴露水平时存在一些不确定因素。一是计算暴露水平时，膳食摄入数据为肉类，而本研究中只计算了羊肉摄入过程中恩诺沙星残留的安全水平，并未对其他肉类品种中恩诺沙星残留和摄入情况进行评估；二是研究中采用的膳食数据来源于2007年中国总膳食研究，距离目前年份较远，中国居民的肉类膳食摄入量可能发生了变化；三是我国未对恩诺沙星的ADI值进行规定，其参考值为国际参考值。