肾消通络方对自发性糖尿病db/db小鼠肾脏炎性损伤及MCP-1、TNF-α水平的影响

杨秀芳， 白秀云， 丁英钧,3*， 陈 亮， 蔡冀民， 常 奕

(1.河北中医学院，河北 石家庄 050200；2.保定市第一中医院，河北 保定 071000；3.河北省中西医结合肝肾病证研究重点实验室，河北 石家庄 050091；4.石家庄市中医院，河北 石家庄 050051)

糖尿病肾脏疾病(diabetic kidney disease, DKD)是由糖脂代谢紊乱导致的一种长期的慢性炎症疾病，其病理改变主要由初期的肾小球肥大、基底膜的逐渐增厚以及细胞外基质的不断沉积，逐渐发展为后期的肾小球硬化[1]。DKD又被认为是一种炎症性疾病，其发生发展与炎症反应密切相关[2-4]。炎症信号通路TLR4/NF-κB和炎性因子MCP-1、TNF-α则被认为是参与DKD病情进展最为重要的因素[5-7]。糖尿病环境下，高表达的TLR4通过MyD88依赖途径激活下游的核转录因子NF-κB，使肾脏的MCP-1、TNF-α呈高表达，从而诱发或加剧炎症反应，使DKD病情进展加速[8]。

肾消通络方是以通络药物为主的自拟方剂，有活血化瘀、益气养阴之效。前期实验表明肾消通络方能够降低尿蛋白，保护肾功能，有较好的抗炎、抗纤维化作用[9-10]，并且还能抑制血管新生和内皮细胞增殖，减轻肾脏病理改变[11]。本次实验拟通过用肾消通络方治疗自发性糖尿病 db/db小鼠，观察小鼠肾脏MCP-1、TNF-α表达的变化，进一步探讨肾消通络方改善db/db小鼠肾脏炎症损伤的作用和潜在机制。

1 材料

1.1 动物 24只雄性自发性2型糖尿病db/db小鼠，7周龄，体质量(37±3) g；8只雄性同遗传背景正常野生型db/m小鼠，7周龄，体质量(24±2)g，均购于南京大学模式动物研究所购入，动物生产许可证号SCXK(苏)2018-0008，实验期间自由饮水进食，环境温度(24±3)℃。

1.2 试剂与药物 肾消通络方组方药材黄芪、乌梢蛇、元参、黄连、地龙、蝉蜕、金雀根、地锦草、鬼箭羽、丹参、红曲均购于河北乐仁堂国药连锁有限公司。吗替麦考酚酯胶囊(批号SH2142，上海罗氏制药有限公司)。TLR4多克隆抗体、MyD88多克隆抗体、NF-κB p65多克隆抗体、TNF-α多克隆抗体(美国Proteintech公司，生产批号分别为00048459、00056689、00057776、00077108)；MCP-1多克隆抗体(英国Abcam公司，批号GR1152-61)；MCP-1、TNF-α试剂盒(上海森雄科技实业有限公司，生产批号分别为SXM043、SXM063)。

1.3 仪器 电泳仪及电泳槽(美国Bio Rad公司)；化学发光成像仪(美国GE公司)；超低温冰箱(日本Sanyo公司)；细胞破碎仪(美国Sonics公司)；高速冷冻离心机(美国Sigma公司)；电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；电热恒温水浴箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；冰箱(青岛海尔集团股份有限公司)。

2 方法

2.1 分组与给药 所有小鼠适应性喂养1周后随机分为西药组(db/db)、模型组(db/db)、中药组(db/db)、正常组(db/m)，每组8只，给药剂量参考《药理与中药药理实验》[12]，中药组小鼠灌胃给予肾消通络方水煎剂(26.8 g/kg)，西药组小鼠灌胃给予吗替麦考酚酯混悬液(0.3 g/kg)，模型组、正常组小鼠灌胃给予同体积1%羧甲基纤维素钠溶液，每天1次，连续8周。

2.2 标本收集 小鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，摘除眼球后收集血液，放入高速冷冻离心机中，4 ℃、10 000 r/min离心10 min，检测血清MCP-1、TNF-α水平。处死小鼠，取出肾脏，剥离包膜，低温保存，用于蛋白表达检测。

2.3 指标检测

2.3.1 血清MCP-1、TNF-α水平 采用酶联免疫吸附法(ELISA)。在37 ℃下于酶标板孔中加入MCP-1、TNF-α对照品及样品各100 μL，静置90 min，加入稀释的抗小鼠MCP-1、TNF-α抗体各100 μL，静置60 min，加入亲和素-过氧化物酶复合物工作液100 μL，静置30 min，在避光条件下滴加100 μL TMB显色液，待充分反应后加入50 μL TMB终止液，最后放到酶标仪中检测MCP-1、TNF-α水平。

2.3.2 肾脏炎性因子和TLR4通路蛋白表达 采用Western blot法，称取小鼠肾组织100 mg放至冰面上，按说明书加入4 μL蛋白酶抑制剂、400 μL裂解液，充分匀浆后静置30 min，离心，取上清液，加5×上样缓冲液，检测蛋白浓度，制胶，上样，90 V恒压电泳，25 V恒压转膜，置于5%～10%脱脂牛奶中，常温封闭2 h，TBST洗涤3次，每次8 min，再将PVDF膜放入一抗稀释液中(稀释比例依次为TLR4 1∶1 000、MyD88 1∶800、NF-κB p65 1∶1 000、MCP-1 1∶800、TNF-α 1∶800)，4 ℃过夜，次日将PVDF膜用TBST洗涤后放入二抗稀释液中(稀释比例为1∶10 000)，常温封闭2 h，TBST洗涤3次，每次8 min，TBS洗涤8 min，避光条件下将PVDF膜放入ECL发光液中至完全浸透，迅速将膜放入化学发光成像分析仪中进行扫描分析，采用Image J软件对蛋白条带进行分析，以灰度值比值为目的蛋白表达量。

3 结果

3.1 血清MCP-1、TNF-α水平 模型组小鼠血清MCP-1、TNF-α水平高于正常组 (P<0.01)；西药组、中药组两者水低于模型组 (P<0.01)，见表1。

表1 肾消通络方对小鼠血清MCP-1、TNF-α水平的影响

3.2 肾脏炎性因子和TLR4通路蛋白表达 模型组小鼠肾脏TLR4、MyD88、NF-κB p65表达及MCP-1、TNF-α水平高于正常组(P<0.01)；西药组、中药组上述因子表达和水平低于模型组(P<0.05，P<0.01)，见图1、表2。

注：A为正常组，B为模型组，C为中药组，D为西药组。图1 各组小鼠肾脏TLR4、MyD88、NF-κBp65及MCP-1、TNF-α表达

表2 肾消通络方对小鼠肾脏TLR4、MyD88、NF-κB及MCP-1、TNF-α表达的影响

4 讨论

DKD的发生涉及许多方面，除既往研究较多的高血糖、遗传、氧化应激等因素外[13-16]，炎症被认为是促进肾脏损伤，导致DKD病情不断进展的重要原因之一。炎症信号通路TLR4/NF-κB以及炎症因子在DKD的发病机制及进展中起着关键作用[17]。TLR4不仅分布在免疫细胞如巨噬细胞、淋巴细胞等表面，在肾脏系膜细胞、足细胞、上皮细胞等细胞表面也有大量表达。TLR4在糖尿病环境下，与肾组织表面的TLR4内源性配体结合而被激活。反过来，肾脏固有细胞、免疫细胞又能在TLR4的作用下被激活，分泌大量炎症因子，诱导或加剧炎症反应。同时，TLR4主要通过MyD88依赖途径激活该信号通路，活化的TLR4与MyD88结合形成复合体，进一步使位于通路下游的核转录因子NF-κB被激活，从而产生大量的MCP-1、TNF-α[18]。高表达的MCP-1、TNF-α等炎症因子又能激活NF-κB并促进单核巨噬细胞的浸润和活化，使其产生更多的TNF-α、IL-6I、TGF-β、L-1β等炎症因子，如此循环往复，使肾脏处于持续的炎症状态，缩短DKD发展为终末期肾病的时间[19]。

DKD是在阴虚为本燥热为标的糖尿病病理基础上不断发展而来，日久气阴两虚，继而阳气受损，渐成阴阳两虚之候。中医认为“久病必虚”，正虚则邪实，机体无力鼓邪外出，导致病理产物如瘀血、痰饮、湿浊等不能及时被清除而瘀积，根据“久病入络”“久病必瘀”的中医理论，日久病邪就会深入肾络，使肾络瘀阻。而长期瘀积在肾络的病邪属陈积，非一般活血药物能及，而虫类药物具有很强的走窜性，能够深入肾络搜剔瘀血，去除陈积，畅通络脉，使邪去络通，正气得复，因此形成了以活血化瘀，益气养阴为主要功效的肾消通络方，方由黄芪、黄连、元参、蝉蜕、乌梢蛇、地龙、金雀根、红曲、地锦草、丹参、鬼箭羽组成。该方含多种虫类药物，活血通络之力较强，能直达病所，祛瘀生新，以通为补，标本兼顾，治疗DKD疗效显著。

结果表明，经过8周药物治疗后，模型组小鼠肾脏和血清中MCP-1、TNF-α水平高于正常组小鼠，而西药组和中药组小鼠肾脏和血清中的MCP-1、TNF-α水平低于模型组，说明肾消通络方能下调小鼠肾脏炎性因子的表达，减轻肾脏损伤。结果还发现，TLR4通路上的蛋白TLR4、MyD88、NF-κB p65在模型组中要高于正常组，而在西药组和中药组中又低于模型组。

综上所述，肾消通络方能下调小鼠肾脏炎性因子MCP-1、TNF-α的表达，改善治疗组小鼠肾组织的炎性损伤，延缓病情进展，可能与肾消通络方抑制炎症通路TLR4/NF-κB p65的信号转导有关。