刺山柑正丁醇部位对MH7A细胞增殖、凋亡的作用

金渭荃， 包晓玮*， 朱东亮， 白栋文， 刘晓禄

(1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆 乌鲁木齐 830052；2.新疆军区保障部药品仪器监督检验站，新疆 乌鲁木齐 830052)

刺山柑CapparisspinosaL.为山柑科山柑属植物，俗称野西瓜[1]。化学研究表明，刺山柑中含有生物碱类[2]、黄酮类[3]、酚酸类[4]等化学成分，具有对关节软骨细胞的保护[5]、抗炎镇痛[6]、抑菌[7]等作用。

类风湿关节炎是以慢性、进行性周身多关节炎为特征的一种自身免疫性疾病[8]，其病理过程为滑膜慢性炎症、增生，形成血管翳；持续的炎症破坏关节软骨、韧带及肌腱，最终导致关节畸形和功能丧失[9]。关节软骨被破坏的主要诱因是过度增殖的滑膜细胞和过度分泌的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)[10]。MMPs是一种几乎能降解所有软骨细胞外基质的一组蛋白酶[11]，其高水平表达是慢性炎症疾病状态的标志[12]。在类风湿关节炎发展过程中，增加的MMPs导致过度的基质降解，失去功能性软骨，并损害关节完整性[13]。p-JNK在类风湿性关节炎成纤维滑膜细胞中有促进滑膜细胞中炎症因子分泌和表达的作用[14]。p-STAT3对于细胞的存活、增殖及迁移起重要作用，并且还可以介导炎症因子及趋化因子的释放[15]。

类风湿关节炎滑膜成纤维细胞系MH7A细胞是研究类风湿关节炎公认的体外细胞模型[16]。本实验通过观察刺山柑正丁醇部位对MH7A细胞增殖、凋亡及蛋白表达的影响，为刺山柑正丁醇部位的深度研究与开发利用提供一定实验和理论基础。

1 材料

1.1 细胞 MH7A细胞(广州莱德盟生物科技有限公司)。

1.2 药物与试剂 刺山柑，购自新疆乌鲁木齐市北园春市场，经新疆农业大学马生军副教授鉴定为刺山柑CapparisspinosaL.。胎牛血清、DMEM高糖培养基、青链霉素、PBS磷酸钾缓冲液(美国Hyclone公司)；HRP标记的GAPDH内参(上海康成生物工程有限公司)；MMP-1、MMP-9、MMP-13(英国Abcam公司)；p-JNK、p-STAT3(美国Affinity Biosciences公司)；Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)、Mouse/Human ads-HRP (美国Southern Biotech公司)。

2 方法

2.1 刺山柑正丁醇部位的制备 取200.00 g刺山柑干燥果实，进行粉碎，过60目筛，分别加入80%、50%乙醇，分别超声提取2次，提取时间为每次50 min，提取功率为575 W，料液比为1∶10，合并醇提取液，减压浓缩(55 ℃)至膏状，得乙醇提取物，以等量蒸馏水将其混悬，随后按1∶2的体积比，依次用石油醚、乙酸乙酯、水饱合正丁醇溶剂对乙醇提取物混悬液进行分级萃取，各溶剂重复萃取4次，收集萃取液，减压浓缩(55 ℃)至10 mL，于真空干燥箱中干燥，得刺山柑正丁醇部位。

2.2 细胞培养 将MH7A细胞接种于含10%胎牛血清和1%双抗的DMEM高糖培养基中，置于5% CO2、37 ℃恒温培养箱中培养。将生长良好的MH7A细胞消化后，利用细胞计数仪进行计数，用RPMI-1640细胞培养液调整细胞密度为1×105/mL。

2.3 CCK-8法检测MH7A细胞增殖抑制率 按“2.2”项下方法处理 MH7A细胞，每孔100 μL接种于96孔板。细胞贴壁生长12 h后，将原有培养基更换为含不同质量浓度刺山柑正丁醇部位的培养基，每组质量浓度分别为0、0.75、1.5、3.125、7.5、15、30 mg/mL，分别培养 24、48 h后，每孔加入10 μL CCK-8试剂，置于37 ℃、5% CO2培养箱中孵育4 h。使用酶标仪在450 nm波长处检测光密度(OD)值，并计算细胞增殖抑制率。实验重复3次。

2.4 流式细胞术检测MH7A细胞凋亡率 按“2.2”项下方法处理 MH7A细胞，每孔2 mL接种于6孔板。待细胞贴壁生长12 h后，将原有培养基更换为含刺山柑正丁醇部位的培养基。将细胞分为5组，每组质量浓度分别为0、0.75、1.5、3.125、7.5 mg/mL。将6孔板置于37 ℃、5% CO2培养箱中，培养24 h。使用AnnexinV-FICT/PI进行染色，避光反应后，通过流式细胞仪检测细胞凋亡率。

2.5 Western blot检测MH7A细胞中MMP-1、MMP-9、MMP-13、p-JNK 和p-STAT3的蛋白表达 按“2.2”项下方法处理MH7A细胞。稀释实验样品，每个样品取2 μL，稀释20倍，BCA法检测样品浓度。电泳，转膜，TBST漂洗5 min，5%脱脂奶粉溶液室温封闭1 h，加入MMP-1、MMP-9、MMP-13、p-JNK及p-STAT3一抗，4 ℃过夜孵育，TBST洗膜，加入相应二抗37 ℃孵育1 h，TBST洗膜，在膜的表面均匀加入化学荧光底物，反应持续5 min。放至暗盒，显影，通过Image J软件统计各蛋白条带的灰度值。

3 结果

3.1 刺山柑正丁醇部位对MH7A细胞增殖的影响 如图1所示，与空白对照组(0 mg/mL)比较，刺山柑正丁醇部位各质量浓度处理对MH7A细胞的增殖均有抑制作用，作用24 h后细胞增殖抑制率均升高(P<0.01)，0.75 mg/mL组细胞增殖抑制率最低为12.76%，7.5 mg/mL组细胞增殖抑制率最高为74.38%；作用48 h后各质量浓度组细胞抑制率均升高(P<0.01)，0.75 mg/mL组细胞增殖抑制率最低为29.08%，7.5 mg/mL组细胞增殖抑制率最高为85.07%。结果表明，随着刺山柑正丁醇部位质量浓度升高对细胞增殖的抑制率增加，且7.5 mg/mL时细胞增殖抑制率达到稳定，随着刺山柑正丁醇部位干预时间的增加细胞增殖抑制率呈现升高趋势。因此，选择0、0.75、1.5、3.125、7.5 mg/mL质量浓度进行后续实验。

注：与空白对照组(0 mg/mL)比较，**P<0.01。图1 不同质量浓度刺山柑正丁醇部位对MH7A细胞的增殖作用

3.2 刺山柑正丁醇部位对MH7A细胞凋亡的影响 如图2～3所示，与空白对照组比较，刺山柑正丁醇部位各质量浓度组均能诱导MH7A细胞发生凋亡(P<0.01)，且细胞凋亡率随着质量浓度的增加而升高，呈现剂量依赖性。质量浓度为0.75 mg/mL时细胞凋亡率最低为3.47%，质量浓度为7.5 mg/mL时细胞凋亡率最高为15.12%。结果表明，刺山柑正丁醇部位能够诱导MH7A细胞的凋亡，并且随着质量浓度的增加抑制率呈现升高趋势。

3.3 刺山柑正丁醇部位对MH7A细胞中MMP-1、MMP-9、MMP-13、p-JNK和p-STAT3蛋白表达的影响 如表1、图4所示，与空白对照组比较，随着刺山柑正丁醇部位质量浓度的升高，MMP-1、MMP-9、MMP-13、p-JNK及p-STAT3的蛋白表达均降低，说明刺山柑正丁醇部位对MMP-1、MMP-9、MMP-13蛋白表达有抑制作用，对p-JNK及p-STAT3通路蛋白也有抑制作用。

4 讨论

现代医学认为类风湿关节炎主要是关节滑膜中的里层细胞异常增殖、炎性细胞浸润、血管翳生成、软骨基质降解，最终导致关节变形及功能障碍[17]。

注：A为空白对照组，B为0.75 mg/mL刺山柑正丁醇部位组，C为1.5 mg/mL刺山柑正丁醇部位组，D为3.125 mg/mL刺山柑正丁醇部位组，E为7.5 mg/mL刺山柑正丁醇部位组。图3 各组MH7A细胞凋亡情况

表1 各组MH7A细胞中相关蛋白的灰度值

注：A为空白对照组，B为0.75 mg/mL刺山柑正丁醇部位组，C为1.5 mg/mL刺山柑正丁醇部位组，D为3.125 mg/mL刺山柑正丁醇部位组。图4 各组相关蛋白表达条图

在病理状态下，类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(RAFLSs)会表现出异常增殖以及凋亡不足的情况，但多种细胞因子由RAFLS释放，如炎性介质、MMPs、趋化因子等，这些因子均可引起软骨破坏，因此需促进滑膜细胞的凋亡，抑制滑膜组织的增生[18]。MH7A细胞作为RAFLS中的一种成熟细胞系，其作用和RAFLSs基本类似，但可以多次传代不影响细胞活性，因此本研究选择MH7A细胞作为类风湿关节炎研究的细胞模型[19]。本研究用不同质量浓度刺山柑正丁醇部位干预MH7A细胞，发现刺山柑正丁醇部位可以抑制MH7A细胞增殖，并能够有效诱导MH7A细胞的凋亡。

在病理状态下，RAFLSs表现为“类肿瘤样”，多条信号通路的异常激活，异常增厚的细胞包裹关节软骨，致使其不能正常代谢并且分泌大量MMPs降解软骨，导致关节活动度降低甚至永久性损伤[20]。在类风湿关节炎中，MMPs水平高并且几乎可降解软骨基质中所有成分，若要保护软骨，应抑制其活性或表达。本研究的结果显示刺山柑正丁醇部位可以抑制MMP-1、MMP-9、MMP-13的表达，可通过负调控MMPs来保护关节软骨。p-JNK可促进滑膜细胞中炎症因子分泌和表达；p-STAT3可促进炎症因子及趋化因子的释放，抑制这2个信号通路后，可降低炎症因子的分泌，能有效抑制类风湿性关节炎发生发展[21]。本研究的结果显示刺山柑正丁醇部位可以抑制p-JNK、p-STAT3的表达，可通过负调控p-JNK、p-STAT3来抑制炎症分子的分泌和表达。

综上所述，刺山柑正丁醇部位可负调控JNK、STAT3信号通路，抑制MH7A细胞增殖，诱导MH7A细胞凋亡，并抑制 MMP-1、MMP-9、MMP-13蛋白表达，为开发刺山柑作为防治类风湿关节炎提供一定理论基础。