参芪复方对2型糖尿病大鼠骨骼肌细胞凋亡的作用

任雪交， 吴贤波， 丁若兰， 朱海燕， 唐宋琪

(1.成都中医药大学，四川 成都 610037；2.成都体育学院，四川 成都 610041；3.成都中医药大学附属医院，四川 成都 610072；4.成都医学院临床医学院第一附属医院，四川 成都 610500；5.海南医学院，海南 海口 571199)

糖尿病骨骼肌病变由糖尿病状态下高血糖持续对骨骼肌及相应血管神经的损害而引发，是2型糖尿病(T2DM)的常见并发症之一，临床主要表现为肌无力，肌肉萎缩等[1-2]。参芪复方由人参、黄芪、山药、山茱萸、生地、天花粉、丹参、制大黄组成，具有益气健脾、清热生津、活血化瘀的功效，临床观察该方可明显改善糖尿病患者的肌肉萎软无力、疼痛、萎缩等症状。前期实验研究表明[3]，参芪复方可改善2型糖尿病大血管病变模型小鼠的糖脂代谢和血管损害，减轻模型动物的骨骼肌细胞萎缩、水肿、断裂和炎症状况，对糖尿病小鼠的骨骼肌具有保护作用。但其作用机制尚不明确。

许多研究表明，肌纤维细胞凋亡在肌肉萎缩中起重要作用[4-6]，且以线粒体功能障碍而激发的细胞凋亡为主要贡献者[7-10]，而Bcl-2家族是介导线粒体损伤引起细胞凋亡的重要成员。因此，本研究拟从骨骼肌线粒体相关凋亡蛋白切入，进一步探究参芪复方对糖尿病骨骼肌细胞凋亡的影响及作用机制。

1 材料

1.1 动物及饲料 30只自发性2型糖尿病GK大鼠，SPF级，雄性，8周龄，体质量(210±10)g；10只Wistar大鼠，SPF级，雄性，8周龄，体质量(210±10)g，均购自常州卡文斯实验动物有限公司，动物生产许可证号SCXK(苏)2016-0010。普通饲料和高脂饲料(基础饲料55%，脂肪10%，胆固醇10%，糖20%，奶粉5%，另加少量微量元素)均由恩施维尔公司提供。

1.2 药物 参芪复方水煎液由成都中医药大学附属医院药剂科提供(批号20190420)，所用药材均由成都中医药大学黄巍教授鉴定为正品。罗格列酮(批号190304，成都恒瑞制药有限公司)。

1.3 试剂 蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物(货号P1050)、BCA蛋白浓度测定试剂盒(货号P0010)、RIPA裂解液(货号P0013B)、PMSF(货号ST506)均购于上海碧云天生物技术有限公司；Bak抗体(货号12105，美国Cell Signaling Technology公司)；Bad抗体(货号ab32445)、Bax抗体(货号ab32503)、Bcl-2抗体(货号ab196495)、Bcl-xL抗体(货号ab178844)、Prism Ultra Protein Ladder(货号ab116028)、Goat anti-Rabbit IgG(H+L) Secondary Antibody HRP(货号ab205118)、Anti-COX Ⅳ antibody (HRP) (货号ab209958)均购于英国Abcam公司；大鼠ACTB内参引物(货号B661202)、大鼠RPS18内参引物(货号B661201)均购于生工生物工程上海(股份)有限公司；RT EasyⅡ(货号RT-01023)、Animal Total RNA Isolation Kit(货号RE-03011)均购于成都福际生物技术有限公司；SsoAdvanced Universal SYBRGreen Supermix(货号1725271)、Clarity Western ECL Substrate(货号170-5060)均购于美国Bio-Rad公司。

1.4 仪器 TSJ-Ⅱ型全自动封闭式组织脱水机、BMJ-Ⅲ型包埋机、PHY-Ⅲ型病理组织漂烘仪均购于常州中威电子仪器有限公司；转轮式切片机(德国徕卡公司)；DeadEnd TM荧光测定TUNEL系统[普洛麦格(北京)生物技术有限公司]；血糖仪(美国Abbott Diabetes Care公司)；电泳仪、荧光定量PCR(美国Bio-Rad公司)；酶标仪(美国ThermoFisher公司)；超微量核酸分析仪(德国IMPLEN公司)；基因扩增仪(杭州朗基科学仪器有限公司)；全自动化学发光凝胶成像系统(北京赛智创业科技有限公司)。

2 方法

2.1 药液制备 参芪复方水煎液制备工艺，称取人参15 g、黄芪15 g、山药10 g、山茱萸10 g、生地10 g、天花粉10 g、丹参10 g、酒制大黄6 g，加入10倍量水，浸泡30 min，煎煮30 min，滤过，收集滤液；再加入8倍量水，煎煮30 min，滤过，合并2次滤液，减压浓缩至含生药量2 g/mL。参芪复方受试药液配制，取参芪复方水煎液30 mL，加生理盐水10 mL，配制成1.5 g/mL混悬液备用。罗格列酮混悬液配制，取罗格列酮1粒，碾碎后加入生理盐水57.1 mL，配制成0.07 mg/mL混悬液备用。

2.2 造模方法 将2型糖尿病模型大鼠适应性饲养1周后，换以高脂饲料喂养，每周监测随机血糖，连续3 d检测随机血糖≥11.1 mmol/L视为造模成功。造模37 d，给药期间同时给予高脂饲料喂养。

2.3 分组及干预 课题组前期实验研究发现，参芪复方临床等效剂量的10倍剂量对2型糖尿病动物模型的血糖、血脂代谢紊乱和骨骼肌病变的改善作用最佳[1]，因此本实验选择了10倍剂量的参芪复方作为中药组。造模成功后，将2型糖尿病大鼠模型随机分为3组，即模型对照组、参芪复方组、罗格列酮组，每组10只，另取10只Wistar大鼠为正常对照组。参芪复方组灌胃给予14.33 g/kg参芪复方混悬液，罗格列酮组灌胃给予0.67 mg/kg罗格列酮混悬液，正常对照组、模型对照组均灌胃等体积生理盐水。每天1次，连续给药8周，8周后处死大鼠。

2.4 标本采集 实验结束后，标本采集处死前12 h禁食不禁水，以2%戊巴比妥(45 mg/kg)麻醉后置于冰盘上，迅速剥离腓肠肌，并切成1 cm×1 cm×0.5 cm的小块以10%的多聚甲醛固定，剩余腓肠肌组织分装至EP管并标记后投入液氮中，于-80 ℃冰箱保存待测。

2.5 骨骼肌细胞凋亡率检测 将10%多聚甲醛固定的腓肠肌组织制成石蜡切片，切片常规脱蜡至水，以水浸泡5～10 min，浸入PBS漂洗2次，每次5 min；制备TUNEL反应混合液，孵育8～10 min，避光将切片浸入PBS漂洗3次，每次5 min，甘油封片，荧光显微镜检测，每张切片随机选取3个视野，进行凋亡细胞分析。

2.6 RT-qPCR检测骨骼肌组织中目的基因表达 用液氮将大鼠腓肠肌组织研磨成粉末状，按Animal Total RNA Isolation Kit说明书提取RNA，微量核酸分析仪检测RNA质量浓度和纯度，将样本RNA质量浓度调整为84 ng/μL，RT EasyⅡ试剂盒将mRNA样本逆转录为cDNA(2×RT OR-EasyTM Mix溶液10 μL，样本10 μL；42 ℃ 15 min逆转录，85 ℃ 5 min失活)，SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix试剂盒检测目标mRNA相对表达量，以ACTB和RPS18作为归一化内参基因。PCR反应体系(20 μL)为2×SYBR Green mixture 10 μL，正反向引物各0.8 μL，cDNA 1 μL，RNase Free water 7.4 μL；进行40个PCR循环，循环后进行熔解曲线实验，观察扩增产物有无非特异性扩增及扩增片段长度。PCR引物序列见表1。

表1 基因引物序列

2.7 Western blot检测骨骼肌组织中目的蛋白表达 剪取100 mg大鼠腓肠肌组织，加入含蛋白酶和磷酸化酶抑制剂的RIPA混合裂解液，冰上匀浆，4 ℃裂解1 h后离心(12 000 r/min，5 min)，收集上清液，BCA法检测总蛋白浓度，每孔以20 μg蛋白上样，100 V电泳，100 V湿转，5%脱脂牛奶封闭2 h，加入相应一抗，4 ℃孵育16 h，二抗室温孵育2 h，ECL试剂盒显影，化学发光成像系统曝光拍摄，凝胶分析系统分析条带净光密度值。

3 结果

3.1 参芪复方对大鼠骨骼肌细胞凋亡的影响 与正常对照组比较，模型对照组大鼠骨骼肌细胞凋亡率升高(P<0.01)；与模型对照组比较，罗格列酮组与参芪复方组大鼠骨骼肌细胞凋亡率降低(P<0.05)；罗格列酮组与参芪复方组比较大鼠骨骼肌细胞凋亡率无明显变化(P>0.05)，见图1、表2。

注：绿色荧光标示凋亡细胞，蓝色荧光标示细胞核。图1 各组大鼠骨骼肌细胞凋亡情况(TUNEL荧光染色，×400)

表2 各组大鼠骨骼肌细胞凋亡率

3.2 参芪复方对大鼠骨骼肌组织Bad、Bak、Bax、Bcl-2、Bcl-xLmRNA表达的影响 与正常对照组比较，模型对照组大鼠骨骼肌组织BadmRNA表达升高(P<0.05)，Bcl-xLmRNA表达降低(P<0.05)；与模型对照组比较，罗格列酮组大鼠骨骼肌组织BadmRNA表达降低(P<0.05)，参芪复方组大鼠骨骼肌组织BakmRNA表达降低(P<0.05)、Bcl-2 mRNA表达升高(P<0.05)，见表3。

3.3 参芪复方对大鼠骨骼肌组织Bad、Bak、Bax、Bcl-2、Bcl-xL蛋白表达的影响 与正常对照组比较，模型对照组大鼠骨骼肌组织Bad、Bax蛋白表达升高(P<0.05，P<0.01)，Bcl-2、Bcl-xL蛋白表达降低(P<0.05，P<0.01)；与模型对照组比较，罗格列酮组大鼠骨骼肌组织Bad、Bax蛋白表达降低(P<0.05，P<0.01)，Bcl-2蛋白表达升高(P<0.01)，参芪复方组大鼠骨骼肌组织Bad、Bax蛋白表达均降低(P<0.05，P<0.01)、Bcl-2蛋白表达升高(P<0.01)，见图2、表4。

表3 各组大鼠骨骼肌组织Bad、Bak、Bax、Bcl-2、Bcl-xL mRNA表达

图2 各组大鼠骨骼肌组织Bad、Bak、Bax、Bcl-2、Bcl-xL蛋白条带图

表4 各组大鼠骨骼肌组织Bad、Bak、Bax、Bcl-2、Bcl-xL蛋白表达

4 讨论

骨骼肌是全身葡萄糖吸收的重要组织之一，也是胰岛素作用的主要靶组织之一，对维持机体葡萄糖动态平衡具有关键性作用。长期处于高血糖环境下的骨骼肌易受损害，其中以氧化型肌纤维受损最为突出，在光镜下主要表现为肌纤维萎缩[11]。研究发现，其发病机制可能与线粒体损伤引起的细胞凋亡有关。Kelley等[12]在2型糖尿病患者的肌肉中观察到线粒体破裂。蒙碧辉等[13]发现，树鼩糖尿病模型的肌组织中存在明显的线粒体损伤和细胞凋亡前状态，提示细胞凋亡可能与糖尿病骨骼肌病变相关。本实验骨骼肌组织TUNEL荧光染色显示，模型对照组大鼠骨骼肌细胞凋亡率高于正常对照组，这进一步说明骨骼肌细胞凋亡可能参与糖尿病骨骼肌病变的发生；参芪复方组与罗格列酮组大鼠骨骼肌细胞凋亡率低于模型对照组，提示参芪复方可改善2型糖尿病大鼠模型的骨骼肌细胞凋亡现象。

Bad、Bak、Bax、Bcl-2、Bcl-xL蛋白共属于B细胞淋巴瘤(Bcl)-2家族，其中Bcl-2、Bcl-xL属于抗凋亡成员，Bad、Bak、Bax属于促凋亡成员。Bcl-2家族在调节细胞凋亡信号上起重要作用，可结合相关蛋白调节线粒体的稳态，参与线粒体外膜孔道的形成，与线粒体外膜通透性有关[14]。细胞色素C(Cyt C)是一种细胞色素氧化酶，位于线粒体内膜外侧，是线粒体呼吸链的重要组成部分，也是一种重要的细胞凋亡调控因子[15]。Bcl-2家族中Bcl-2、Bcl-xL等抗凋亡成员可抑制线粒体释放Cyt C，Bak、Bad、Bax等促凋亡成员则促进线粒体释放Cyt C。在细胞内凋亡刺激因子作用下，促凋亡蛋白Bak、Bax等在线粒体外膜上形成线粒体内部通向胞质的孔道，使得Cyt C得以通过线粒体外膜进入细胞质，并在ATP的作用下与凋亡酶激活因子(Apaf-1)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9(caspase-9)组成凋亡小体，引起下游与细胞生命相关蛋白的降解，最终引起细胞凋亡[16-17]。

本实验研究发现，与正常对照组比较，模型对照组大鼠骨骼肌组织BadmRNA表达升高、Bcl-xLmRNA表达降低，而Bad、Bax、Bcl-2、Bcl-xL的蛋白表达均有明显的改变，证实Bcl-2家族参与了2型糖尿病大鼠模型的骨骼肌细胞凋亡过程；与模型对照组比较，参芪复方组大鼠骨骼肌BakmRNA表达与Bad、Bax蛋白表达均降低，Bcl-2 mRNA及蛋白表达均升高。提示参芪复方可影响2型糖尿病大鼠模型骨骼肌细胞Bcl-2家族中促凋亡成员Bak、Bad、Bax以及抗凋亡成员Bcl-2的表达。

综上所述，参芪复方可通过调控Bak、Bad、Bax、Bcl-2的表达，减少2型糖尿病大鼠模型骨骼肌细胞凋亡，从而发挥改善糖尿病骨骼肌病变的作用。