不同发育时期栀子果实中6种成分的变化规律

夏鸿东， 宋丹丹， 赵安娜， 罗扬婧， 罗光明

(江西中医药大学药学院，江西 南昌 330000)

栀子GardeniajasminoidesEllis作为我国第一批药食两用的中药材，具有消肿止痛、泻火除烦等功效[1]。栀子果实中不仅含有丰富的膳食纤维[2]，也含有多种活性成分[3-8]。在植物的生长发育过程中，会产生具有药理作用和生理活性的次生代谢物质，这些次生代谢物质会在植物的各器官中合成积累，再通过特殊的运输方式到达植物的各组织部位，不同器官的生长发育和不同成分的累积均被视为一个动态过程[9-10]。因此植物在不同生长发育阶段所含有成分的种类和含量均有较大的差异。现行《中国药典》中要求栀子“9～11月果实呈红黄色时采收”[1]，《本草纲目》[11]云：“霜后收之”。作为果实类药材，过早过晚的采收，都会对栀子的产量和品质造成破坏[12]，从而影响栀子的临床应用。

根据栀子果实不同发育时期的颜色变化特点，历经绿色、黄绿、黄、黄红、红色的变化过程，将其分为幼果、青果、黄果、黄红果和红果5个发育时期。本实验区别于以往仅对栀子果实不同采收期的分析[6, 13-14]，针对栀子果实的整个发育过程进行研究，以不同发育阶段的栀子果实为研究对象，利用HPLC测定栀子果实中6种成分含量，明确不同发育时期栀子果实中6种成分的变化规律，以期为进一步探索栀子成分积累机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司)； KQ3200DB型超声波清洗机(昆山市超声仪器有限公司)；Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司)。栀子苷(批号S14J10Y79596)、京尼平苷酸(批号Z24A10X95926)、京尼平-1-β-龙胆双糖苷(批号P27S10F96112)、绿原酸(批号Y20A11K111541)、西红花苷Ⅰ(批号P26J10F91588)、西红花苷Ⅱ(批号P27J9S64478)对照品购自上海源叶生物技术有限公司，纯度均大于98%。乙腈为色谱纯；磷酸、甲醇为分析纯；水为超纯水。

1.2 药材 新鲜栀子采自江西省九江市栀子种植基地，于开花后30 d(2020年6月25日)到成熟(2020年10月25日)每隔30 d取样，共5次，采样时间分别为2020年6月25日(幼果期)、2020年7月25日(青果期)、2020年8月25日(黄果期)、2020年9月25日(黄红果期)、2020年10月25日(红果期)，采集后立刻放入液氮中速冻。不同发育时期的栀子果实见图1，按照2020年版《中国药典》方法进行处理。

图1 不同发育时期的栀子果实Fig.1 Gardenia jasminoides fruits at different developmental stages

1.3 成分含量测定

1.3.1 色谱条件 Durashell C18色谱柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流动相乙腈(A)-0.1%磷酸(B)，梯度洗脱，程序见表1；体积流量1 mL/min；柱温30 ℃；检测波长238、328、440 nm；进样量10 μL。

1.3.2 对照品溶液制备 精密称取栀子苷、京尼平-1-β-龙胆双糖苷、京尼平苷酸、绿原酸、西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ 对照品适量，制成质量浓度分别为0.430、0.128、0.155、0.058、0.162、0.064 mg/mL贮备液，取适量用甲醇稀释，即得。

表1 梯度洗脱程序

1.3.3 供试品溶液制备 精密称取不同发育时期果实的干燥粉末0.1 g，加入25 mL甲醇，称定质量后超声处理20 min，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取10 mL续滤液至25 mL量瓶中，甲醇定容，过0.22 μm微孔滤膜，即得。

1.3.4 线性关系考察 精密吸取贮备液适量，倍比稀释成6个质量浓度，在“1.3.1”项色谱条件下进样测定。以各成分质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。色谱图见图2。

表2 各成分线性关系

1.京尼平苷酸 2.京尼平-1-β-龙胆双糖苷 3.绿原酸4.栀子苷 5.西红花苷Ⅰ 6.西红花苷Ⅱ1.geniposidic acid 2.genipin-1-β-gentioside 3.chlorogenic acid4.geniposide 5. crocin Ⅰ 6. crocin Ⅱ图2 各成分HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of various constituents

1.3.5 精密度试验 取对照品溶液，在“1.3.1”项色谱条件下进样测定6次，测得京尼平苷酸、京尼平-1-β-龙胆双糖苷、绿原酸、栀子苷、西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ峰面积RSD分别为1.84%、1.76%、1.96%、1.74%、1.88%、1.93%，表明仪器精密度良好。

1.3.6 重复性试验 取同一份果实适量，按“1.3.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，在“1.3.1”项色谱条件下进样测定，测得京尼平苷酸、京尼平-1-β-龙胆双糖苷、绿原酸、栀子苷、西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ峰面积RSD分别为2.38%、2.12%、2.62%、1.41%、2.47%、1.40%，表明该方法重复性良好。

1.3.7 稳定性试验 取同一份供试品溶液，于0、2、4、8、16、24、48 h在“1.3.1”项色谱条件下进样测定，测得京尼平苷酸、京尼平-1-β-龙胆双糖苷、绿原酸、栀子苷、西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ峰面积RSD分别为2.88%、1.10%、1.67%、1.27%、2.95%、1.06%，表明溶液在48 h稳定性良好。

1.3.8 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的果实样品0.05 g，平行6份，加入等量对照品，按“1.3.3”项下方法制备供试品溶液，在“1.3.1”项色谱条件下进样测定，结果见表3。

1.3.9 样品含量测定 取5个发育时期果实，按“1.3.3”项下方法制备供试品溶液，在“1.3.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表4。

2 结果

2.1 栀子苷、京尼平苷酸、京尼平-1-β-龙胆双糖苷含量变化规律 由图3A可知，在栀子果实发育过程中，栀子苷含量呈逐渐下降的变化趋势，不同发育时期果实中栀子苷含量在46.37～136.94 mg/g之间。幼果期该成分含量显著高于其他4个时期，其原因为栀子苷在幼果期的栀子果实中大量合成，随着该部位进一步发育成熟，该成分发生逐步降解而转化为其他成分。由图3B可知，不同发育时期果实中京尼平苷酸含量在19.04～36.92 mg/g之间，随着果实发育成熟整体呈逐渐下降的变化趋势，幼果期该成分含量显著高于黄果期、黄红果期和红果期3个时期，而除幼果期外其他4个时期无显著差异。由图3C可知，不同发育时期果实中京尼平-1-β-龙胆双糖苷含量在0～19.50 mg/g之间，整体呈先上升再下降的变化趋势，在幼果期该成分还未合成，青果期开始产生，随着果实进一步发育成熟而不断积累合成，直至黄红果期达到最大值；黄果期和红果期相比，该成分含量无显著差异，但均显著高于幼果期和青果期，表明其累积在黄红果期达到最大值，但随着果实发育成熟可能发生降解。

表3 各成分加样回收率试验结果(n=6)

表4 各成分含量测定结果

注：不同小写字母之间代表差异有统计学意义(P<0.05)。图3 不同发育时期样品中栀子苷、京尼平苷酸、京尼平-1-β-龙胆双糖苷含量变化趋势Fig.3 Variation trends of geniposide, geniposidic acid and genipin-1-β-gentioside contents in samples at different growth stages

2.2 西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ含量变化规律 由图4可知，不同发育时期果实中西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ含量整体呈上升的变化趋势，在幼果期、青果期还未合成；在黄果期果实开始合成两者，但含量较低，仅分别为1.86、0.17 mg/g；红果期果实中两者含量最高，分别为11.65、0.87 mg/g，显著高于黄果期、黄红果期。

注：不同小写字母之间代表差异有统计学意义(P<0.05)。图4 不同发育时期样品中西红花苷Ⅰ、西红花苷Ⅱ含量变化趋势Fig.4 Variation trends of crocin Ⅰ and crocin Ⅱ contents in samples at different growth stages

2.3 绿原酸含量变化规律 由图5可知，不同发育时期果实中绿原酸含量在0.85～5.27 mg/g之间，整体呈逐渐下降的变化趋势；幼果期最高，为5.27 mg/g，显著高于其他4个时期；青果期该成分含量仅次于幼果期；黄果期、黄红果期、红果期其含量无显著性差异。

注：不同小写字母之间代表差异有统计学意义(P<0.05)。图5 不同发育时期样品中绿原酸含量变化Fig.5 Variation trends of chlorogenic acid content in samples at different growth stages

3 讨论

栀子作为我国的大宗药材之一，在日常生活和临床治疗中一直有着广泛的应用。通过高效液相色谱技术测定了栀子不同发育时期果实中3种环烯醚萜类成分，2种二萜类成分和1种有机酸酯类成分，采用了全波长扫描法发现各成分的最大吸收波长分别为238、328和440 nm。

目前，国内外学者对于栀子的研究，主要关注栀子的不同部位、不同产地、不同采收期或不同炮制方式成分含量测定[13, 15-18]，但是对于不同发育时期栀子中多个成分含量的报道较少[19-20]。本研究测定5个发育时期栀子果实中6种成分的含量，结果发现栀子苷、绿原酸和京尼平苷酸在幼果期含量达到峰值，随着栀子果实的发育成熟，含量呈逐渐下降的趋势，这与前人的研究结果一致[17]。京尼平-1-β-龙胆双糖苷的含量在栀子的幼果期含量最低，随着栀子果实的发育，在黄红果期达到峰值，随后在红果期含量稍下降，呈先上升后下降的趋势。而西红花苷类成分则随着栀子果实的发育，含量呈逐渐升高的趋势，在红果期达到了峰值，这与刘春雷等[16]的研究结果一致，但是栀子果实在发育初期并未产生西红花苷类成分，直至果实由绿变黄才开始合成，这与付小梅等[12]的研究结果相吻合，表明西红花苷类成分影响栀子果实的颜色。

综上所述，本研究利用HPLC法同时测定栀子不同发育时期中6种成分含量，探讨6种成分的变化规律，结果表明，在栀子的不同发育时期，不同成分的含量和变化规律有一定的差异，其中以栀子苷为代表的环烯醚萜类成分总体呈下降趋势，而西红花苷类成分则呈上升趋势。这说明栀子果实在发育初期，主要合成栀子苷和京尼平苷酸。2020年版《中国药典》规定为栀子苷不得低于1.8%[1]，若单纯的提取栀子果实中栀子苷成分，建议在幼果期或青果期提取栀子苷比较适宜。而随着果实的发育成熟，转为主要合成西红花苷类成分，建议在红果期提取西红花苷类成分，此时栀子苷含量虽然降至46.37 mg/g，但仍可以达到《中国药典》的要求。