妇科千金方及其拆方、单味饮片主要成分分析及10种成分测定

伊美瑾， 粟 倩， 郑志玉， 陈 典， 林丽美

(湖南中医药大学药学院，湘产大宗药材品质评价湖南省重点实验室，湖南 长沙 410208)

妇科千金方由穿心莲、单面针、功劳木、千斤拔、金樱根、当归、党参、鸡血藤8味药材组成，具有清热除湿、益气化瘀的功效[1]，临床上用于治疗慢性宫颈炎、子宫内膜炎、盆腔炎性疾病等妇科疾病[2]。然而，目前鲜有妇科千金方化学成分的报道，也尚未揭示其配伍规律及主要药效物质基础[3]。

拆方是对方剂配伍原理及质量进行研究的重要手段之一[4]，为了研究妇科千金方质量标准及其配伍规律，本实验依据该方功能主治引入拆方，分别为抗炎方、抑菌方、补益方。方中君药千斤拔所含染料木素、染料木苷具有良好的抑菌活性[5-6]；金樱根所含芦丁具有抗炎、抗菌、免疫调节的作用[7]；穿心莲所含穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯具有抗菌、消炎的作用[8]；功劳木所含小檗碱、单面针所含木兰花碱具有良好的抗菌、抗肿瘤作用[9-10]；当归所含藁本内酯、党参所含党参炔苷、鸡血藤所含原儿茶酸具有抗炎、抗癌、免疫调节等多种药理活性[11-14]。

目前，对妇科千金方的质量控制仅限于通过TLC法、HPLC法对几种指标成分进行含量测定，无法全面控制该方质量。因此，本实验在中药质量标志物原则的基础上[15]，依据妇科千金方功能主治制备拆方(抗炎方、抑菌方、免疫方)，采用HPLC法测定该方主要成分在拆方、单味饮片中的归属和迁移情况，以期为深入研究其质量标准及配伍规律提供参考。

1 材料

1.1 仪器 Agilent 1260型高效液相色谱仪，配置四元泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器(DAD)、Agilent Chemstation 色谱工作站(version B.04.02)(美国Agilent Technologies公司)；KQ-500DE型数控超声仪(功率200 W、频率40 kHz，昆山市超声仪器有限公司)，QUINTIX224电子天平[十万分之一，赛多利斯科学仪器(北京)有限公司]。

1.2 试剂与药物 原儿茶酸(批号DY008199-50-3，纯度98%)、党参炔苷(批号DD0035-136085-37-5，纯度98%)、藁本内酯(批号DST200610-007，纯度98%)对照品均购于成都乐美天医药科技有限公司；木兰花碱(批号M-026-17016，纯度98%)、染料木素(批号DST190915-002，纯度98%)、染料木苷(批号DST200319-003，纯度98%)、小檗碱(批号DST191113-009，纯度98%)对照品均购于成都瑞芬思生物科技有限公司；穿心莲内酯(批号110797-20110，纯度98.7%)、脱水穿心莲内酯(批号110854-201308，纯度99.7%)对照品均购于中国食品药品检定研究院；芦丁(批号T10J10Z90356，纯度98%)对照品购于上海源叶生物科技有限公司。

妇科千金方组方饮片均由株洲千金药业股份有限公司提供，经湖南中医药大学中药鉴定教研室龚力民副教授鉴定，千斤拔为豆科植物大叶千斤拔Moghaniamacrophylla(Willd．)O. Kuntze的干燥根[16]，金樱根为蔷薇科植物金樱子RosaLaevigata Michx的干燥根，穿心莲为爵床科植物穿心莲Andrographispaniculata(Burm. f.) Nees的干燥地上部分，功劳木为小檗科植物阔叶十大功劳Mahoniabealei(Fort.)Carr.的干燥茎，单面针为芸香科植物蚬壳花椒ZanthoxylumdissitumHemsley的干燥根[17]，鸡血藤为豆科植物密花豆SpatholobussuberectusDunn的干燥藤茎，当归为伞形科植物当归Angelicasinensis(Oliv.) Diels的干燥根，党参为桔梗科植物党参Codonopsispilosula(Franch.) Nannf.的干燥根。

色谱纯乙腈(美国Tedia公司)；色谱纯甲醇(德国Merck公司)；色谱纯甲酸(天津市科密欧化学试剂有限公司)；水为超纯水(Direct-Q®5UV纯水仪制备)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Kromasil 100-5-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)- 0.1%甲酸(B)，梯度洗脱(0～65 min，5%～45%A，65～80 min，45%～90%A)；体积流量1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长 254 nm；进样量10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 供试品溶液 将穿心莲、单面针、功劳木、金樱根、千斤拔、当归、党参、鸡血藤粉碎，过60目筛，精密称取粉末各0.1 g，混合均匀，作为妇科千金方；精密称取千斤拔、金樱根粉末各0.1 g，混合均匀，作为抗炎方；精密称取穿心莲、单面针、功劳木粉末各0.1 g，混合均匀，作为抑菌方；精密称取当归、党参、鸡血藤粉末各0.1 g，混合均匀，作为补益方。将上述全方、拆方、单味饮片粉末置于不同具塞锥形瓶中，加入10倍量70%甲醇，称定质量，超声提取30 min(功率200 W、频率45 kHz)，取出，放冷，70%甲醇补足减失的质量，混合均匀，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.2 对照品溶液 精密称取原儿茶酸、木兰花碱、芦丁、染料木苷、党参炔苷、小檗碱、穿心莲内酯、染料木素、脱水穿心莲内酯、藁本内酯对照品适量，70%甲醇稀释，即得(各成分质量浓度分别为0.000 9、0.057 4、0.029 8、0.012 3、0.000 4、0.026 4、0.181 4、0.002 4、0.135 5、0.093 9 mg/mL)。

2.3 精密度试验 取同一份全方，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定6次，测得原儿茶酸、木兰花碱、芦丁、染料木苷、党参炔苷、小檗碱、穿心莲内酯、染料木素、脱水穿心莲内酯、藁本内酯相对保留时间RSD分别为0.29%、0.24%、0.13%、0.17%、0.19%、0.14%、0.17%、0.21%、0.10%、0.06%，相对峰面积RSD分别为1.16%、1.20%、1.34%、1.60%、2.40%、1.58%、1.54%、1.23%、0.92%、1.28%，表明仪器精密度良好。

2.4 重复性试验 取全方6份，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得原儿茶酸、木兰花碱、芦丁、染料木苷、党参炔苷、小檗碱、穿心莲内酯、染料木素、脱水穿心莲内酯、藁本内酯相对保留时间RSD分别为0.76%、0.57%、0.58%、0.55%、0.45%、0.24%、0.38%、0.22%、0.31%、0.12%，相对峰面积RSD分别为1.80%、2.09%、2.49%、1.21%、1.21%、2.24%、0.77%、2.82%、0.79%、1.14%，表明该方法重复性良好。

2.5 稳定性试验 取同一份全方，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、8、12、24 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得原儿茶酸、木兰花碱、芦丁、染料木苷、党参炔苷、小檗碱、穿心莲内酯、染料木素、脱水穿心莲内酯、藁本内酯相对保留时间RSD分别为0.10%、0.41%、0.28%、0.22%、0.19%、0.14%、0.20%、0.11%、0.21%、0.10%，相对峰面积RSD分别为2.05%、2.33%、2.45%、1.08%、0.60%、0.80%、1.03%、1.92%、0.59%、1.37%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.6 线性关系考察 取对照品溶液适量，在“2.1”项色谱条件下进样1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 μL测定。以各成分质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 各成分线性关系

2.7 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知的8味药材粉末各0.05 g，平行6份，加入对照品溶液适量，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤，在“2.1”项色谱条件下进样测定，测定回收率。结果，各成分平均加样回收率(RSD)分别为原儿茶酸98.68%(1.82%)、木兰花碱96.51%(2.62%)、芦丁97.99%(1.57%)、染料木苷98.32%(2.10%)、党参炔苷98.29%(2.48%)、小檗碱100.21%(2.84%)、穿心莲内酯99.32%(2.96%)、染料木素102.03%(0.88%)、脱水穿心莲内酯100.39%(2.97%)、藁本内酯98.88%(1.43%)。

2.8 色谱峰归属 吸取供试品溶液10 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定，结果见图1。由此可知，3号峰(芦丁)、4号峰(染料木苷)、8号峰(染料木素)是妇科千金方、抗炎方共有成分，2号峰(木兰花碱)、6号峰(小檗碱)、7号峰(穿心莲内酯)、9号峰(脱水穿心莲内酯)是妇科千金方、抑菌方共有成分，1号峰(原儿茶酸)、5号峰(党参炔苷)、10号峰(藁本内酯)是妇科千金方、补益方共有成分。

注：a～e分别为妇科千金方、对照品、抗炎方、抑菌方、补益方。1. 原儿茶酸 2.木兰花碱 3.芦丁 4.染料木苷 5.党参炔苷6.小檗碱 7.穿心莲内酯 8.染料木素 9.脱水穿心莲内酯 10.藁本内酯1.protocatechuic acid 2.magnoflorine 3.rutin 4.genistin5.lobetyolin 6. berberine 7. andrographolide 8.genistein9.dehydrated andrographolide 10. ligustilide图1 妇科千金方与拆方HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of Gynecological Qianjin Formula and decomposed formulas

比较抗炎方与金樱根、千斤拔之间特征峰的归属，结果见图2。由此可知，3号峰(芦丁)是金樱根、抗炎方共有成分，4号峰(染料木苷)、8号峰(染料木素)是千斤拔、抗炎方共有成分。

注：c、f～h分别为抗炎方、对照品、金樱根、千斤拔。3.芦丁 4.染料木苷 8.染料木素3.rutin 4.genistin 8.genistein图2 抗炎方、金樱根、千斤拔HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of anti-inflammatory formula, R. Laevigata and M.macrophylla

比较抑菌方与穿心莲、单面针、功劳木之间特征峰的归属，结果见图3。由此可知，2号峰(木兰花碱)是单面针、抑菌方共有成分，6号峰(小檗碱)是功劳木、抑菌方共有成分，7号峰(穿心莲内酯)、9号峰(脱水穿心莲内酯)是穿心莲、抑菌方共有成分。

注：d、i～l分别为抑菌方、对照品、穿心莲、单面针、功劳木。2.木兰花碱 6.小檗碱 7.穿心莲内酯 9.脱水穿心莲内酯2.magnoflorine 6.berberine 7.andrographolide 9.dehydrated andrographolide图3 抑菌方、穿心莲、单面针、功劳木HPLC色谱图Fig.3 HPLC chromatograms of bacteriostasis formula, A. paniculata, M. bealei and Z. dissitum

比较补益方与党参、当归的鸡血藤之间特征峰的归属，结果见图4。由此可知，1号峰(原儿茶酸)是鸡血藤、补益方共有成分，5号峰(党参炔苷)是党参、补益方共有成分，10号峰(藁本内酯)是当归、补益方共有成分。

注：e、m～p分别为补益方、对照品、当归、党参、鸡血藤。1. 原儿茶酸 5. 党参炔苷 10. 藁本内酯1.protocatechuic acid 5.lobetyolin 10.ligustilide图4 补益方、当归、党参、鸡血藤HPLC色谱图Fig.4 HPLC chromatograms of tonifying formula, A. sinensis, C. pilosula and S. suberectus

综上所述，妇科千金方10个特征峰均可在其拆方、单味饮片中找到归属峰，表明它们之间具有良好的相关性，主要成分归属见表2。

表2 主要成分归属

2.9 样品含量测定 精密称取妇科千金方及其拆方、单味饮片粉末适量，置于具塞锥形瓶中，按“2.2.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下各进样测定3次，外标法计算含量，结果见表3。

表3 各成分含量测定结果(mg/g)

3 讨论

本实验首先考察各成分在220、254、268、280、320 nm检测波长处的响应值，发现在254 nm处各成分均有良好的吸收。再考察甲醇(乙腈)-水、甲醇(乙腈)- 冰醋酸、甲醇(乙腈)- 甲酸等流动相，发现乙腈-甲酸洗脱时各成分分离度、峰形较好。然后，考察提取溶剂50%甲醇、70%甲醇、甲醇，发现70%甲醇提取时各成分得率最高，峰型较好。

结果表明，妇科千金方主要色谱峰均能归属于拆方和单味饮片中，含量依次为单味饮片>拆方>复方。中药复方是中医临床最常用的治疗药物，方中成分的变化不仅是单味饮片中成分的简单相加，还是多味药材配伍后共同发挥的作用，故仅把单体成分含量作为复方检测指标不够全面。今后，还应与微量成分和药效评价相结合，寻找复方质量控制标志物，为其深入研究提供基础。

本实验首次将拆方作为妇科千金方与单味饮片的桥梁，采用HPLC法对三者进行成分分析。今后，课题组将在此基础上进一步开展妇科千金方配伍的物质基础、药效评价、物效关系研究，有助于更好地研究该方质量评价方法、组方原则及配伍内涵，为其药效物质基础的阐释及配伍规律的挖掘提供基础。