TNF-α和槟榔碱对口腔黏膜成纤维细胞增殖和羟脯氨酸蛋白表达的影响及姜黄素对其影响的作用

夏丽 王金竹 李冰

口腔黏膜下纤维化(oral submucous fibrosis, OSF)是一种是具有癌变倾向的口腔黏膜病变，累及部位包括口腔、口咽部和食道黏膜。纤维化能够导致口腔黏膜、黏膜下层、肌层等组织的纤维弹性丧失，临床上可表现为口干、灼痛、进刺激性食物疼痛、进行性张口受限、吞咽和发音困难等症状[1]。OSF的病因不明确，流行病学调查证实，咀嚼槟榔是其主要的致病因素。OSF病变过程主要伴有炎症反应、氧化损伤和纤维性变。目前治疗方法多采用局部注射的保守治疗和手术治疗，还没有有效的治愈方法。姜黄素(curcumin)是一种从姜黄根茎中提取和分离出来的化合物[2]，是姜黄的主要活性成分之一。姜黄素具有广泛的生物学作用，如抗氧化、镇痛、抗炎、消毒、抗肿瘤、抗病毒、抗菌、抗真菌等[3-4]。

对OSF的研究，需要建立口腔黏膜下纤维化的细胞模型。本研究采用TNF-α和槟榔碱模拟外界环境对口腔黏膜成纤维细胞的刺激作用，评价两种方法在建立OSF细胞模型中的作用，并探索姜黄素在两种OSF细胞模型中的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 实验细胞与主要材料、仪器

实验细胞：人口腔黏膜成纤维细胞(武汉普诺赛)。胎牛血清(Gibco，美国)；DMEM培养基(Hyclone，美国)；重组人TNF-α(北京义翘神州科技)；槟榔碱、姜黄素(成都曼思特)；CCK-8试剂盒(DoJinDo，日本)；MTT试剂盒(上海碧云天)；人羟脯氨酸(Hyp)酶联免疫吸附测定试剂盒(上海江莱)；生物倒置显微镜(Olympus，德国)；酶标仪(深圳雷杜)。

1.2 细胞培养

人口腔黏膜成纤维细胞培养于含10%胎牛血清、 100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的DMEM培养基中，在5%CO2、37 ℃恒温培养箱中培养，细胞长至80%消化传代。

1.3 细胞增殖检测

CCK-8检测：选用对数生长期细胞， 4 000 个/孔接种于96 孔细胞板中，实验分为：对照组，TNF-α 100、1 000、10 000 U/mL组和对照组，槟榔碱10、 20、 40 μg/mL组。培养箱中分别培养24、 48、 72 h后向每孔加入10 μL CCK-8反应液，将培养板在培养箱内避光孵育4 h，用酶标仪测定在450 nm处的吸光度。MTT实验检测：按上述方法培养消化细胞，分为1 000 U/mL TNF-α组和40 μg/mL槟榔碱组，两组细胞计数4 000 个/孔接种于96 孔细胞板中，两组分为对照组， 10、 20、 40 μmol/L姜黄素组。培养箱中分别培养12、 24、 48 h后向每孔加入10 μL MTT反应液，将培养板在培养箱内孵育4 h，用酶标仪测定在595 nm处的吸光度。

1.4 羟脯氨酸蛋白检测

取各组48 h的细胞培养上清，采用人羟脯氨酸(Hyp)酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒检测。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 2 种模型中口腔黏膜成纤维细胞的变化

2.1.1 TNF-α对口腔黏膜成纤维细胞增殖的影响 不同浓度TNF-α作用于口腔黏膜成纤维细胞， CCK-8结果显示，在24 h时，TNF-α浓度为1 000 U/mL和10 000 U/mL能够显著促进口腔黏膜成纤维细胞的增殖；在48和72 h时，TNF-α浓度为100、 1 000、 10 000 U/mL均能够促进口腔黏膜成纤维细胞的增殖(图 1)。

图 1 TNF-α及槟榔碱对人口腔黏膜成纤维细胞增殖的影响(* P<0.05)

2.1.2 槟榔碱对口腔黏膜成纤维细胞增殖的影响 不同浓度的槟榔碱作用于口腔黏膜成纤维细胞，CCK-8结果显示(图 1)，在24、 48和72 h时，槟榔碱浓度为10、 20、 40 μg/mL均能够抑制口腔黏膜成纤维细胞的增殖。

2.1.3 TNF-α和槟榔碱对口腔黏膜成纤维细胞羟脯氨酸合成的影响 选择TNF-α浓度为1 000 U/mL，槟榔碱浓度为40 μg/mL组，与对照组比较羟脯氨酸的合成，结果显示(图 2)，口腔黏膜成纤维细胞羟脯氨酸的合成，在TNF-α刺激下增多，在槟榔碱作用下减少。

图 2 TNF-α和槟榔碱对口腔黏膜成纤维细胞羟脯氨酸合成的影响

2.2 姜黄素对两种模型口腔黏膜成纤维细胞的影响

2.2.1 不同浓度姜黄素对TNF-α刺激的口腔黏膜成纤维细胞增殖的影响 不同浓度的姜黄素作用于浓度为1 000 U/mL TNF-α刺激的口腔黏膜成纤维细胞，MTT结果显示(图 3)，在12 h时、 5、 20、 40 μmol/L的姜黄素促进细胞增殖；在24 h时， 5 μmol/L的姜黄素促进细胞增殖， 20、 40 μmol/L的姜黄素抑制细胞增殖；在48 h时， 5 μmol/L的姜黄素促进细胞增殖， 40 μmol/L的姜黄素抑制细胞增殖。

图 3 不同浓度姜黄素对TNF-α、槟榔碱刺激的口腔黏膜成纤维细胞增殖的影响

2.2.2 不同浓度姜黄素对槟榔碱刺激的口腔黏膜成纤维细胞增殖的影响 不同浓度的姜黄素作用于浓度为40 μg/mL槟榔碱刺激的口腔黏膜成纤维细胞，MTT结果显示(图 3)，在12 h时，10和40 μmol/L的姜黄素促进细胞增殖；在24 h时， 40 μmol/L的姜黄素抑制细胞增殖；在48 h时，5 μmol/L的姜黄素促进细胞增殖， 40 μmol/L的姜黄素抑制细胞增殖。

2.2.3 不同浓度姜黄素对TNF-α刺激的口腔黏膜成纤维细胞羟脯氨酸合成的影响 不同浓度的姜黄素作用于TNF-α刺激的口腔黏膜成纤维细胞， 结果显示(图 4)，与对照组相比，羟脯氨酸合成均减少，并表现为浓度依赖性。

图 4 不同浓度姜黄素对TNF-α及槟榔碱刺激的口腔黏膜成纤维细胞羟脯氨酸合成的影响

2.2.4 不同浓度姜黄素对槟榔碱刺激的口腔黏膜成纤维细胞羟脯氨酸合成的影响 不同浓度的姜黄素作用于槟榔碱刺激的口腔黏膜成纤维细胞，结果显示(图 4)，与对照组相比，羟脯氨酸合成均减少，并表现为浓度依赖性。

3 讨 论

OSF的病因并不明确，病变主要表现为结缔组织胶原纤维的堆积和变性，局部通常伴有炎症相关的细胞浸润和细胞因子分泌[5-6]。口腔黏膜成纤维细胞是产生胶原纤维的主要细胞之一，其增殖和胶原蛋白的分泌受多种炎症和纤维化相关的细胞因子、槟榔提取物等调控。

TNF-α是炎症反应中最重要的细胞因子之一，对多种细胞都具有强大的调节作用。有研究采用TNF-α刺激正常的口腔黏膜成纤维细胞，模拟OSF的疾病过程[7]。本研究也采用了此方法， 观察到较长时间和较高浓度的TNF-α，能够明显促进口腔黏膜成纤维细胞的增殖，而在较短时间和较低浓度的刺激下，细胞并未表现出明显的增殖反应。随着时间的延长和浓度的增高，细胞的增殖更加明显，表现出一定的时间依赖性和浓度依赖性。羟脯氨酸是胶原中特有的氨基酸，是研究结缔组织的重要指标[8]。在口腔黏膜成纤维化过程中，胶原纤维变性，结缔组织增生，羟脯氨酸蛋白增多。本研究在TNF-α浓度为1 000 U/mL刺激细胞后，羟脯氨酸的分泌明显增高。

槟榔的刺激是口腔黏膜下纤维化的主要致病因子，槟榔碱是槟榔的重要成分。本研究用不同浓度的槟榔碱作用于口腔黏膜成纤维细胞后，抑制细胞增殖，并表现为一定的浓度依赖性。选择槟榔碱浓度为40 μg/mL刺激细胞后，羟脯氨酸的分泌降低。槟榔碱作用于细胞后，细胞增殖和胶原分泌的结果与TNF-α相反。槟榔碱可以通过直接作用于口腔黏膜成纤维细胞，刺激结缔组织生长因子的产生，形成纤维化[9]，同时产生间接作用影响口腔黏膜成纤维细胞。例如槟榔碱作用于口腔黏膜的其他细胞，如口腔角质形成细胞、血管内皮细胞等[10]，这些细胞产生炎症和纤维化的细胞因子，使口腔黏膜成纤维细胞发生纤维化改变。

姜黄素是姜黄提取物，具有多种细胞功效，如抗炎、抗纤维化、抗氧化等[11-12]。有研究显示，在OSF中使用姜黄素可显著降低与OSF的发生和进展相关的结缔组织生长因子[13]。也有临床研究利用姜黄素治疗口腔黏膜下纤维化，取得了一定的效果[14-15]。本研究用不同浓度的姜黄素作用于两种黏膜下纤维化的细胞模型，探索其作用效果。结果显示在两种细胞模型中，较长的时间和较高的浓度下，姜黄素能够抑制细胞增殖，抑制羟脯氨酸的分泌。采用1 000 U/mL TNF-α和40 μg/mL槟榔碱作用的细胞模型， 40 μmol/L姜黄素在48 h抑制细胞增殖，不同浓度的姜黄素均能抑制羟脯氨酸的分泌。

在本研究检测的两项指标中，TNF-α作用的细胞模型可以造成细胞增殖和胶原蛋白的分泌增加，槟榔碱则相反。长时间和高浓度的姜黄素能够抑制2种模型中的细胞增殖，抑制胶原蛋白的分泌。但姜黄素在OSF中的作用机制、作用机理和用药途径、方法等方面，还有待进一步研究。