一种含有异氰酸酯功能基团单体的生物安全性初步研究

杨振宇 段龙彦 周唯 高婧 方明 陈吉华

自1955 年Buenocore报道可以在酸蚀处理后的釉质表面使用含丙烯酸酯基团的树脂材料进行粘接以来[1]，树脂粘接修复技术便成为牙体组织保存修复的关键技术[2]。为进一步提高粘接耐久性的研究中，外源性粘接剂和牙体组织之间的额外化学结合提供了新思路[3]。本课题组近年来选用IPDI和HEMA为原料，成功合成出含有-NCO功能基团的可聚合树脂单体(异氰酸酯-氨基甲酸-甲基丙烯酸酯单体，isocyanate-terminated urethane methacrylate prepolymer， UMP)[4]。本实验结合课题组前期研究,旨在解决反应产物掺杂无关化合物较多这一问题，对产物进行纯化，并初步评价该单体的生物安全性。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料与试剂

异佛尔酮二异氰酸酯(IPDI)(北京百灵威科技有限公司)；甲基丙烯酸羟乙酯(HEMA)[阿拉丁试剂(上海)有限公司]；双酚A双甲基丙烯酸缩水甘油酯(Bis-GMA)、双酚A乙氧基化二甲基丙烯酸酯(Bis-EMA)、二甲基丙烯酸氨基甲酸乙酯(UDMA)、三乙二醇二甲基丙烯酸酯(TEGDMA)、二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)(MilliporeSigma，美国)；CCK-8试剂盒(上海七海复泰生物科技有限公司)；α-MEM培养基(HyCLone，美国)；胎牛血清(Gibco，美国)。

1.2 主要仪器

MS-H-PRO+数控加热型磁力搅拌器(SCILOGEX，美国)；RE-2000A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)； LC-20AT高效液相色谱仪(岛津公司，日本)。

1.3 合成路线

见图 1。

图 1 目的物合成路线

1.4 合成步骤

氮气气氛下，在装有温度计和搅拌磁子的圆底烧瓶里依次加入IPDI 20.0 g(89.97 mmol)、10滴催化剂(DBTBL-丙酮溶液，体积比1∶20)和200 mL无水丙酮在40 ℃恒温油浴锅中搅拌反应20 min后，滴加11.7 g(89.97 mmol)HEMA，检测反应完全后停止。

待冷却至室温，硅胶制样，柱色谱分离纯化(PE/EA=5/1， v/v),溶剂旋蒸得到无色油状物(10 g)。

1.5 纯度测试和结构表征

运用高效液相色谱仪对UMP的纯度进行测试，用干燥丙酮将UMP稀释至5 ppm，在室温条件下，吸收波长为254 nm下进行纯度检测。

使用核磁共振波谱仪对UMP的结构进行定性分析。以500 μL d-DMSO-d6为溶剂，加入20 mg UMP。待检测液清晰透明后，在400 MHz条件下进行氢谱(1HNMR)检测。

1.6 体外细胞毒性试验[5-6]

将Bis-GMA、Bis-EMA、TEGDMA、UDMA以及UMP分别与含双抗的α-MEM制备浓度梯度20、40、60、80、100、120、140、160 以及180 μg/mL的单体培养液。将第五代人牙髓干细胞以1×104个/孔密度接种到96 孔板上，每孔加入200 μL α-MEM培养基(含20% FBS， 100 U/mL青霉素G， 50 mg/mL抗坏血酸)。细胞贴壁培养后，更换为上述单体配制成的不同浓度的单体培养液，普通培养基组记作空白对照组。37 ℃培养24 h后每孔加入10 μL CCK-8，再24 h后使用酶标仪检测各孔在450 nm波长处的吸光度。

1.7 急性溶血试验[7]

用注射器抽取日本大耳白兔血液，制备稀释抗凝兔全血并稀释。将1 mg UMP加入10 mL生理盐水记为实验组，阴性对照组为10 mL生理盐水，阳性对照组为10 mL蒸馏水，各组制备3 个平行样。在上述各组均加入稀释抗凝兔全血0.2 mL，孵育并离心后检测于545 nm处吸光度值，计算溶血率。溶血率大于5%方可表明单体具有溶血作用。

1.8 短期全身毒性试验[8]

将30 只6 周龄Balb/c小鼠(体重15～18 g，雌雄各半)随机均分为3 组。灌胃前禁食4 h。分别使用UMP(溶于玉米油)、玉米油、Bis-GMA(溶于玉米油)作为药物，其中UMP和Bis-GMA按照与小鼠体重120 mg/kg的比例进行配制。 3 组均按照药品与小鼠体重比例4 μL/g对小鼠进行灌胃，分别记作实验组、对照组A、对照组B。灌胃后如前正常喂养，每天定时观察临床特征，记录体重。 7 d后过量麻醉处死,取心脏、肾脏、肝脏等，石蜡包埋，组织切片，HE染色。

1.9 口腔黏膜刺激试验[9]

取4 只6 周龄SD大鼠，雌雄各半。将大鼠麻醉后口腔黏膜消毒。用直径10 mm的棉球浸湿20 mg UMP，缝在大鼠左侧颊囊，同样10 mm棉球浸湿生理盐水后缝合固定在大鼠右侧颊囊。如前正常喂养7 d后过量麻醉处死大鼠，取颊囊处口腔黏膜，石蜡包埋，组织切片，HE染色。

2 结 果

实验结果依据ISO 10993和中华人民共和国医药行业标准相关量表进行分析评估。数据采用SPSS 19.0单因素分析, α=0.05。

2.1 纯度测试

如图 2所示，HPLC谱图显示在吸收波长为254nm时UMP浓度为95.322%，保留时间为3.514 min。

图 2 UMP的HPLC谱图

2.2 核磁共振图谱表征

见图 3。

图 3 UMP的 1H-NMR谱图(DMSO-d6)

2.3 体外细胞毒性试验

单体的细胞毒性结果如图 4，随着单体浓度增大，各组细胞活性均呈现降低趋势。相比较而言，UDMA与UMP的细胞毒性相似，半抑制浓度(LC50)位于140 μg/mL； Bis-GMA的细胞毒性最大，TEGDMA的毒性最低。根据细胞相对增殖率(RGR)=实验组平均吸光度/阴性对照组平均吸光度的公式计算，RGR数值大于75%，细胞毒性为I级。表明UMP单体细胞毒性良好。

图 4 不同树脂单体的细胞毒性

2.4 急性溶血试验

根据表 1中测得的吸光度值，按照溶血率=(试验组吸光度-阴性对照组吸光度)/(阳性对照组吸光度-阴性对照组吸光度)×100%，计算得UMP单体在兔血中溶血率为3.6%(<5%)，表明UMP单体无急性溶血作用。

表 1 各组溶血实验吸光度数值

2.5 短期全身毒性试验

经过7 d的观察， 3 组试验动物未见运动功能减退、呼吸困难、震颤现象等其它临床中毒特征，无实验动物死亡。处死动物后取出心、肾、肝肉眼观察均未见明显异常。组织切片观察如图 5， 实验组与两个对照组相比较未见明显异常。

图 5 心脏、肾、肝组织学观察(HE, ×200)

连续7 d记录小鼠体重，取每组小鼠体重平均值数据如图 6，雌雄分别记录。由图 6可得三组小鼠体重均随观察时间逐渐增长， 雄性小鼠体重增加普遍快于雌性小鼠。分析趋势线斜率可见三组小鼠体重增速大致相同，实验组小鼠体重增速略快于两个对照组。由组织学观察和体重变化可得，UMP单体对小鼠未见短期全身毒性作用。

图 6 小鼠7 d内体重变化

2.6 口腔黏膜刺激试验

7 d观察期内，含药物棉球与黏膜贴合紧密，无脱落。肉眼观察实验组和对照组均未见颊囊黏膜有溃疡、糜烂、红肿等变化。组织学观察如图 7，实验组和对照组黏膜切片情况相似，上皮和结缔组织正常，无异常角化、未见棘层异常改变等其它异常病理性变化。表明UMP单体对大鼠口腔黏膜无明显刺激作用。

3 讨 论

如何改善牙本质粘接的效果一直是口腔修复领域关注的热点。胶原是牙本质粘接界面中含量较高的粘接介质[10]，现有的粘接树脂单体与胶原纤维之间几乎不存在任何化学结合，而单体的单纯物理渗透无法将粘接界面的牙源性成分和外源性树脂有机整合[11-13]。因此，在粘接剂中加入可以和牙本质胶原形成化学结合的功能成分，理论上可以引入额外的化学粘接力来改善牙本质粘接强度及稳定性[14]。本实验在前期研究基础上，将UMP纯度提升到95%以上，这为对UMP的进一步研究、利用提供了良好的基础和极大的便利。我们在此基础上对其进行生物安全性研究， 为其将来的临床应用提供一定的实验基础。

细胞毒性试验中研究对象Bis-GMA、Bis-EMA等[15]都是作为粘接单体已在临床广泛应用，因此以此作为对照，有较强说服力。结果显示UMP与UDMA细胞毒性相似，优于Bis-GMA，半抑制浓度LC50位于140～160 μg/mL之间。可以认为实验单体对人牙髓干细胞无显著细胞毒性。

短期全身毒性试验表明灌胃后对小鼠未造成不良影响，可以证明实验单体对实验动物无短期全身毒性作用。口腔黏膜刺激试验经肉眼和组织学观察实验组与对照组均无显著差异。表明实验单体对实验动物口腔黏膜组织无显著刺激性反应，可应用于口腔环境。溶血试验结果显示实验单体在兔血中溶血率为3.6%，符合国标规定不大于5%的要求，表明实验单体无急性溶血作用。

综上所述，分析上述四项实验结果，表明本课题组制备的UMP单体有良好的生物安全性，为其进一步的性能研究和临床应用奠定了基础。本课题组将进一步对UMP单体参与的粘接过程和效应进行后续探索，以期为牙本质粘接引入化学成分带来新曙光。