代谢组学在类风湿关节炎诊断和治疗中的研究进展

吕蒙莹，梁巧玲，罗照勇，倪腾洋，刘延庆

(扬州大学医学院，转化医学研究院，国家中医药管理局胃癌毒邪论治重点研究室，江苏 扬州 225001)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种严重危害人类健康的慢性自身免疫性疾病，其基本病理特征为滑膜衬里层增生和炎性细胞浸润(即滑膜炎)[1]。与健康人群相比，RA患者增生的滑膜细胞会与新生微血管形成滑膜血管翳，向关节软骨内侵袭性生长，形成血管翳/软骨结合，这一结构是造成RA病人关节破坏，关节畸形，功能障碍的病理基础。RA发病率约为0.5%～1.0%，任何年龄段均可发病，多见于35～50岁成年人[2]，由于致残率高且无法完全治愈，给患者及其家庭带来了沉重的心理和经济负担。早诊断、早治疗对于预防该疾病进一步发展至关重要，越来越多的学者将代谢组学技术应用于RA的早期诊断、药物疗效预测与评价研究中，现就其研究进展进行综述。

1 RA代谢组学研究概述

代谢组学(metabolomics/metabonomics)这一概念最初是在20世纪末由Nicholson等[3]提出，是继基因组学、蛋白组学和转录组学之后迅速发展起来的一门新兴组学(-omics)学科,它利用现代分析技术，定量研究生物体在不同状态下(如给药前后)，所含内源性小分子代谢物(一般指MW<1 000)种类、数量变化的动态规律。代谢组学的研究对象是生物体内参与物质代谢、能量传递和信息传导的全体小分子物质即代谢组(metabolome)，因此其研究步骤主要包括生物样品预处理(代谢物提取)、数据采集(代谢物检测)和数据分析(差异代谢物发现)3个部分[4]。

Li等[5]通过文献调研发现在RA代谢组学研究中，常选用RA患者血清、尿液和滑膜液，虽然滑膜液比血液和尿液更能反映其关节的病理变化，但滑膜液只能从有关节液溢出的RA或骨关节炎(osteoarthritis，OA)患者中获得，很难从相对应的健康人群中获取。同样，关节组织(例如软骨和骨)样本也很难从人体中大量获取。代谢物检测主要依赖于核磁共振共振技术(1H-,13C-NMR)和基于质谱的液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)、气相色谱-质谱联用技术(GC-MS)和质谱成像技术(MSI)的快速发展[6]。质谱的主要优势在于对代谢物的高灵敏度和高覆盖率快速分析，并且可与多种色谱技术结合实现代谢物的有效分离，而NMR在非破坏性、重复性、定量和结构鉴定等方面具有不可比拟的优势，因此越来越多的代谢组学研究开始将多种分析技术联合使用从而极大的拓展了代谢物的检测范围，也使检测结果可以相互印证[7]。代谢物检测获得的大量数据需要经过预处理和多元统计分析。数据预处理的目的在于将原始图谱转换为数据矩阵并消除或降低实验操作和仪器分析过程中的误差，一般分为峰识别、峰匹配与对齐、归一化、标准化等步骤，其中NMR数据还需要进行峰积分或分段积分。模式识别是代谢组学研究中常用的多变量分析方法，如主成分分析和正交偏最小二乘判别分析，目前多种软件或程序语言如SIMCA-P、Unscrambler、Matlab、R等均可实现多变量分析。代谢通路分析可借助人类代谢组HMDB数据库、代谢通路数据库(Biocyc)和基于网络的代谢组学数据处理一体化软件MetaboAnalyst[4]。

2 代谢组学在RA诊断中的应用

代谢组学的检测对象是脂质、糖类、氨基酸、有机酸和核酸等内源性小分子代谢物，作为生物体内一系列生化反应的终产物，能够综合反映机体在多种因素(如基因，饮食，生活方式等)作用下受疾病侵袭的影响。RA早期临床症状与其他类型关节炎难以区分，而作为一种自身免疫性疾病，早期诊断和治疗能有效防止病情恶化，因此发现特异性强、灵敏度高的RA诊断标志物至关重要。

2.1 RA诊断生物标志物Tab 1汇总了代谢组学在RA诊断标志物发现领域的应用。Surowiec等[8]收集了瑞典北部生物库中RA患者发病前捐献的血浆样本，发现RA患者确诊前血浆中溶血磷脂酰胆碱(LPCs)、色氨酸相关代谢物以及大部分磷脂和鞘磷脂水平显著升高。在一项大规模(132名RA患者，104名健康者)RA代谢组学研究中，Yousri等[9]测定了血浆中927个代谢物,发现其中32个代谢物与RA相关，包含了之前报道过的硫酸脱氢异雄甾酮(DHEAS)，皮质醇和雄烯二酮等甾体类代谢物，并且发现皮质类固醇的治疗能够引起这些甾体类代谢物水平的变化。OA和RA是关节炎中最常见的两种形式，虽然都与年龄相关，但发病机理完全不同，Anderson等[10]发现与OA患者相比，RA患者滑膜液中糖酵解和三羧酸循环相关代谢物含量较低，这与RA患者炎症反应、滑膜增生和缺氧症状更严重的情况相吻合，而OA患者滑膜液中牛磺酸含量较高可能与软骨下骨硬化有关。Dubey等[11]采用基于NMR的代谢组学技术分析RA与反应性关节炎(ReA)患者血清样本发现，缬氨酸、亮氨酸、赖氨酸/精氨酸和苯丙氨酸这四组代谢物可作为区分RA与ReA的生物标志物。干燥综合症(sjogren’s syndrome,pSS)和RA均为自身免疫性疾病，Li等[13]发现与pSS患者和健康人群相比，3个代谢物(4-甲氧基苯基乙酸，L-亮氨酸，L-苯丙氨酸)可以作为RA的特异性标志物，ROC曲线分析表明这组代谢物的灵敏度为93.30%，特异性为95.2%。

Tab 1 Application of metabolomics in biomarker discovery for RA diagnosis

2.2 区分中医寒、热证RA属于中医“痹症”范畴，在中医证候研究中，多将RA分为寒证(寒湿痹阻证)和热证(湿热痹阻证)进行辨证论治。Gu等[14]采用基于LC-MS和GC-MS的代谢组学技术对57例RA患者和23例健康者的血浆标本进行分析，发现RA患者磷酸肌醇、脂质、氨基酸、葡萄糖、抗坏血酸、乙醛酸和二羧酸酯代谢异常，进一步将RA患者分为寒证和热证后发现，RA热证患者血浆中甘氨鹅脱氧胆酸钠、脯氨酸、饱和及单不饱和磷脂酰胆碱浓度高于RA寒证患者，而尿素、游离脂肪酸和多不饱和磷脂酰胆碱含量低于RA寒证患者。Herman等[15]对39例RA患者进行尿液和血浆代谢组学分析及症状谱分型，发现寒热证型RA患者的C-反应蛋白和类风湿因子水平相同，但“关节红肿”、“关节肿胀”等临床症状显示两组患者的炎症水平存在差异，尿液代谢组学分析结果表明，RA热证患者的11种酰基肉毒碱水平均高于RA寒证患者，说明寒热证患者可能在肌肉分解水平上存在差异，RA寒证患者的DHEAS水平相对较低，说明RA寒证患者的下丘脑-垂体-肾上腺轴功能可能受到抑制。Guo等[16]利用基于LC-MS和GC/MS的代谢组学技术，对具有典型中医寒热证候的RA患者血浆代谢谱进行了分析，结果表明与健康对照组相比，寒、热证RA均会引起氨基酸、碳水化合物和脂质代谢物水平的变化，但寒证RA患者具有蛋白质和胶原分解紊乱、糖酵解和有氧氧化降低以及能量代谢加快等特点，可以用于RA寒热证的区分。

3 代谢组学在RA治疗中的应用

3.1 预测药物治疗效果TNF抑制剂是RA治疗中常用的生物改善病情抗风湿药物(biological disease-modifying antirheumatic drugs，bDMARDs)，但仍有1/3的患者对TNF抑制剂治疗无效或疗效较差，鉴于治疗效果的不确定性以及该类药物昂贵的价格，对TNF抑制剂治疗效果的早期预测至关重要，越来越多的组学技术开始应用于TNF抑制剂RA疗效预测生物标志物的发现[17]。Priori等[18]采用1H-NMR技术测定了27位女性RA患者在采用依那西普Etanercept治疗前及治疗6个月后的血清代谢轮廓谱。根据EULAR(European League Against Rheumatism)标准将患者按临床治疗效果分为疗效良好、基本有效和无效3组，发现治疗前的血清代谢轮廓谱可以区分这三类患者,并且疗效良好患者血清中异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸和葡萄糖水平在治疗后显著升高，而3-羟基丁酸酯水平显著降低。Sweeney等[19]采用1H-NMR和UPLC-MS/MS技术测定了23位RA患者在原有甲氨蝶呤治疗基础上加入利妥昔单抗Rituximab治疗前后的血清代谢轮廓谱，将患者根据6个月后的治疗效果分为治疗有效者和治疗无效者后发现治疗有效者在治疗前血清中7个极性代谢物和15个脂质代谢物含量与治疗无效者相比具有显著性差异。Dudka等[20]同时采用了1H-NMR,LC-MS和GC-MS技术测定了25位RA患者在采用bDMARDs治疗前以及治疗3个月后的血浆代谢轮廓，并记录了治疗前及治疗3、6、12、18个月后的视觉模拟评分，28处关节疾病活动度评分(DAS 28)和血沉。治疗方案包括甲氨蝶呤和3种TNF-α抑制剂(阿达木单抗、依那西普、赛妥珠单抗)或IL-6的单克隆抗体托珠单抗。患者根据治疗效果分为治疗有效者和治疗无效者。对有疗效者的划分是根据EULAR标准，要求DAS28得分在治疗后至少下降1.2并且得分低于3.2。代谢组学研究结果表明，治疗有效者血浆中24个代谢物在治疗后发生了显著变化，涉及氨基酸、多肽、脂质、维生素等，并发现有疗效和无疗效者血浆中11个代谢物含量在治疗前具有显著差异，其中N-乙酰半乳糖胺和N-乙酰神经氨酸在治疗后3个月仍具有显著性差异，进一步ROC曲线分析结果表明这两个代谢物是预测bDMARDs治疗效果的潜在生物标志物。

3.2 探索药物作用机制雷公藤多苷片作为RA治疗中常用的中成药，在临床治疗方案中常与甲氨蝶呤联合使用，但其共同作用机制仍不清楚，Wang等[21]对来自中日友好医院的44名RA患者进行为期12周的甲氨蝶呤和雷公藤多苷片单用或联用治疗，发现雷公藤多苷片与甲氨蝶呤疗效相当，但单用组均没有联合治疗组效果好，进一步采用定量血浆药物化学和拟靶向代谢作学方法对血浆中7个甲氨蝶呤代谢物、13个雷公藤多苷片主要活性成分和19个内源性差异代谢物进行定量分析，结果表明雷公藤多苷片与甲氨蝶呤联合治疗既没有增加甲氨蝶呤代谢物引起的药物毒性，也没有影响雷公藤多苷片主要活性成分的吸收，并且能够使RA引起的体内代谢物水平变化恢复正常。为了验证痹祺胶囊的临床有效性、安全性和作用机制，Wang等[22]将70位RA患者随机分为两组进行为期24周的治疗，一组为痹祺胶囊与甲氨蝶呤联用，一组为来氟米特与甲氨蝶呤联用，并记录不同阶段的治疗效果，发现两者并无显著性差异，并且痹祺胶囊组的副反应明显低于来氟米特组。通过对血清和尿液样本的代谢组学分析发现痹祺胶囊治疗有效的患者尿液中脂肪酸含量丰富而酰基肉毒碱含量降低，表明痹祺胶囊可以使RA患者能量代谢恢复平衡。为探究临床常用中成药祖师麻片的作用机制，Shan等[23]采用胶原诱导关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠模型，同时选取血清和粪便样本进行基于GC-MS的代谢组学研究，发现与对照组相比，CIA模型组大鼠的血清中31个代谢物，粪便中30个代谢物发生了显著变化，涉及三羧酸循环、糖酵解、脂肪酸和嘌呤代谢，而服用祖师麻片可以使大部分代谢物含量向对照组水平方向变化。进一步对粪便中的短链脂肪酸进行含量测定发现祖师麻片可以调节CIA大鼠粪便中丙酸、丁酸和戊酸的水平。清络饮是治疗RA热症的常用中药，Zuo等[24]联合采用网络药理学和代谢组学技术发现清络饮不仅能减轻CIA大鼠的症状，防止关节破坏，还能降低甲氨蝶呤引起的肝损伤和骨髓抑制，这可能与清络饮能够引起CIA大鼠体内嘌呤、嘧啶和戊糖磷酸代谢的变化有关。

4 结论与展望

目前代谢组学主要应用于RA的早期诊断、发病机制和药物疗效预测与评价等领域，涉及细胞、动物和临床生物样本，其未来主要发展趋势包括：(1)生物标志物的验证：虽然RA代谢组学研究已经积累了丰富的实验数据，但目前仍缺乏对发现的差异代谢物采用不同批次生物样本进行含量的确证以及采用不同方法进行分析结果的验证；(2)靶向性和拟靶向性代谢组学分析：在非靶向性代谢组学分析结果的基础上，针对某一类型的代谢物如脂类(脂质代谢组学)或某一特定代谢通路，参考FDA生物样品分析的方法学验证指导原则，建立定量分析方法；(3)与其他组学数据的联合分析：作为系统生物学的重要组成部分，代谢组学与基因组学、蛋白质组学数据的关联分析将为RA诊断和治疗生物标志物的发现提供新的思路和方法。目前RA的诊断标准主要针对已经出现的症状，无法在早期区分不同类型的关节炎性疾病，研究表明早期介入可有效延缓RA进展，因此患者发病前的临床样本同样具有重要研究价值。虽然近年来大量生物制剂应用于RA临床治疗，但昂贵的治疗费用以及治疗效果的不确定性，常常使患者望而却步，因此，与基因组学相结合，发现能够预测抗RA生物制剂疗效的代谢标志物意义重大。随着分析技术的不断发展以及代谢组学分析流程的日益规范化，RA代谢组学研究将为RA的诊断和治疗提供重要参考价值。