LncRNAs在过敏性疾病中的研究进展

王晓钰，肖 洁，薛 玲

(山东中医药大学药学院，山东 济南 250355)

过敏性疾病是指机体接触过敏原后，免疫系统发生紊乱的一系列疾病。该疾病特征为免疫球蛋白E(immunoglobulin E，IgE)介导的2型免疫过强，伴随辅助性T细胞(helper T cell,Th)-1/Th2失衡，2型细胞因子，如白介素(interleukin，IL)-4、IL-5及IL-13等分泌增加。像过敏性鼻炎、过敏性哮喘、食物过敏以及特应性皮炎等均属于这类疾病。全球有超过30%的人口受过敏性疾病的影响，并且近年来发病率不断上升。过敏性疾病显著降低了患者的生活质量，其反复发作的特点使患者压力增大、抑郁、甚至可能危及生命，从而造成重大的社会经济负担[1]。过敏性疾病的发病机制涉及环境、免疫和基因等多种因素，目前研究主要集中于Th1和Th2失衡以及屏障功能受损，因此明确过敏性疾病的发病机理，寻求安全有效的药物以及治疗靶点迫在眉睫。

近年来研究发现，长链非编码RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)参与诸多疾病发生和发展，可调控许多生物学过程[2]。尤其在免疫调节方面的作用越来越受到关注。在先天性或适应性免疫反应中，lncRNAs参与多种细胞的调控，像单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞均存在lncRNA的差异表达[3]。lncRNAs是免疫应答的重要调节因子，过敏性疾病的发生、发展及复发与lncRNAs密切相关，但lncRNAs在过敏性疾病中的具体作用机制尚不清楚，对其进行深入研究具有重要意义。本文将围绕几种常见的过敏性疾病，对lncRNAs在过敏性疾病中的研究进展进行总结。

1 lncRNA的生物学功能和基因表达的调控

绝大多数的lncRNA的转录和加工方式与典型的蛋白质编码mRNA类似[4]，lncRNA经RNA聚合酶II转录后，再拼接，即可多聚腺苷化。但与mRNA不同的是，lncRNA富集组蛋白H3K9三甲基(H3K9me3)启动子，并且lncRNA包含较少的低效剪接的外显子[5]。

虽然lncRNAs缺乏开放阅读框而不能直接编码蛋白质，但由于lncRNAs能够结合蛋白质、DNA和其他RNA，因此其分类和功能是多种多样的。lncRNA又分为5类：反义lncRNA、增强子lncRNA、基因间lncRNA、双向lncRNA和内含子lncRNA。有些lncRNA位于细胞核内，可以作为染色质修饰酶或转录因子的引导或支架，以顺式或反式方式调控邻近基因或整个基因组的基因表达；lncRNA能够调控转录过程，其作用主要通过调控转录反应酶、转录激活分子等来发挥；lncRNA还参与了转录后调控、mRNA加工、剪接和转运以及翻译过程；lncRNA作为内源性非编码小RNA(microRNA，miRNA)海绵，能够竞争性结合miRNA进而调控mRNA表达，这种基于lncRNA-miRNA-mRNA的内源竞争RNA(competing endogenous RNAs,ceRNA)网络调控模式在不同疾病中扮演着重要角色[6]。此外，有些lncRNA作为蛋白质的诱饵，能够阻碍其功能或加工。例如，lncRNAs可以影响正常的蛋白(去)磷酸化。

2 lncRNA在过敏性哮喘中的作用

过敏性哮喘是一种常见的肺部疾病，患者常表现出气道炎症反应、气道高反应性以及气道重塑等特征。过敏性哮喘发病率的持续增加，已在全球范围内造成了巨大的经济负担，严重影响着人们的生活质量。表观遗传机制在这些细胞的调节中有突出的作用，其中lncRNAs参与过敏性哮喘的发病进程，并作为关键分子介导多个信号通路，进而调控气道炎症和气道重塑。

气道重塑是过敏性哮喘发病过程中非常重要的环节，与气道中多种结构和功能细胞密切相关，包括成纤维细胞活化、上皮细胞增强和气道平滑肌细胞(airway smooth muscle cells，ASMCs)增殖。Austin等[7]对重症哮喘患者ASMCs中差异表达的lncRNA进行检测分析，发现其中lncRNA-plasmacytoma variant translocation(PVT1)在糖皮质激素不敏感的重度哮喘患者中过表达。进一步研究显示，沉默lncRNA-PVT1可抑制IL-6基因和蛋白水平的表达。并且PVT1在调节重症哮喘患者ASMCs增殖方面具有很大潜力，结果提示lncRNA-PVT1可能作为ASMCs表型的预测分子。另外，也有研究发现，lncRNA-transcription factor 7(TCF7)通过靶向线粒体内膜结构域转位酶1(translocase of inner mitochondrial membrane domain containing 1，TIMMDC1)促进人ASMCs的生长和迁移，从而激活蛋白激酶B信号，为哮喘治疗提供了新的可能靶点[8]。

LncRNA参与调控Th1和Th2 的平衡。Zhu等[9]对嗜酸性哮喘患者的外周血进行RNA测序，发现了差异表达的lncRNA。进一步研究显示，lncRNA-000127在嗜酸性哮喘患者CD4+T细胞中特异性高表达，并通过调控GATA结合蛋白3通路进而促进Th2炎症，提示lncRNA-000127可作为嗜酸性哮喘的生物标志物，靶向lncRNA-000127可能是治疗嗜酸性哮喘Th2炎症的有效手段。另有研究报道，哮喘患者血液中lncRNA-metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1(MALAT1)表达上调，miR-155表达下调，MALAT1通过海绵作用机制结合抑制CD4+T细胞中miR-155的表达，进而调控Th1/Th2的失衡[10]。

已有报道显示，Th17/调节性T细胞(regulatory T cells，Treg)的失衡是参与哮喘发病的重要机制，像IL-17A、IL-17F、IL-22这些Th17型细胞因子的上调，以及Treg型细胞因子[如IL-10和转化生长因子(TGF)-β]的下调能够介导的中性粒细胞募集和气道炎症恶化。研究发现lncRNA对调节Th17/Treg的失调有重要作用。体内干扰及过表达实验结果显示lncRNA-maternally expressed 3(MEG3)可以上调Th17相关的促炎细胞因子(IL-17、IL-22)和维甲酸相关孤核受体γt(retinoid-related orphan nuclear receptor γt，RORγt)[11]，其机制为lncRNA-MEG3与miR-17结合，竞争性抑制miR-17与RORγt的结合来阻止RORγt mRNA的降解。提示lncRNA-MEG3/miR-17/RORγt轴可影响哮喘患者Th17/Treg平衡，该研究将为临床治疗提供有力依据。

另外，有研究者检测了哮喘患者恶化期、缓解期以及健康志愿者血浆中细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2A(INK4)位点lncRNA反义非编码RNA(lncRNA-ANRIL)的表达。结果显示与缓解期组或对照组相比，哮喘恶化期患者lncRNA-ANRIL表达显著性升高，并且可以负调控miR-125a，结果提示ANRIL/miR-125a轴在哮喘的发病机制中发挥重要作用，lncRNA-ANRIL可能成为诊断哮喘恶化和气道炎症程度的重要指标[12]。另外，最新研究显示[13]，lncRNA-nuclear paraspeckle assembly transcript 1(NEAT1)能够与miR-124的相互作用，增加哮喘加重风险和严重程度，并和炎症因子如肿瘤坏死因子TNF-α、IL-1β和 IL-17增加呈正相关。结果说明lncRNA-NEAT1可能作为哮喘风险评估以及严重程度的新靶标。还有研究发现，哮喘小鼠沉默lncRNA-AK085865，可通过调节巨噬细胞极化，抑制M2巨噬细胞进而减少2型先天淋巴细胞(group 2 innate lymphoid cells，ILC2)的数量，最终抑制哮喘炎症[14]。除此之外，细胞因子IL-4、IgE等的表达也与lncRNA-brain cytoplasmic RNA 1(BCYRN1)有着明显的正相关，哮喘患者的病情与lncRNA-BCYRN1的表达水平有着密切的相关性。

由此可见，lncRNAs能够调控气道重塑、Th1/Th2平衡以及Th17/Treg平衡等过程，进而影响过敏微环境，在过敏性哮喘的发生、发展和复发中发挥关键作用(Tab 1)。并且lncRNAs在过敏性哮喘中的作用机制多集中于和特异性miRNA的结合，从而调控miRNA的靶基因表达水平，这是很多lncRNAs基于ceRNA调控网络的共同机制。但其差异在于不同的lncRNAs可能通过调控一个或多个miRNA从而改变靶基因的表达水平，最终影响不同的下游途径，如ILC2细胞、Th2细胞以及Th17细胞等细胞因子的分泌。这对lncRNAs作用靶点的探寻，以及深入的具体机制探索具有提示意义，这些特异性的lncRNA还可以作为对病情风险预测、评估、预后和监测的一项重要指标。

3 lncRNA在过敏性鼻炎中的作用

过敏性鼻炎(allergic rhinitis，AR)是指在变应原刺激下，在鼻黏膜中诱导的炎症反应。该炎症反应过程包括IgE介导的肥大细胞脱颗粒，进而募集嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和T细胞，进一步促进Th2细胞因子的分泌，如IL-4和IL-5，进一步促进了IgE的合成和嗜酸性粒细胞的增多。AR主要特征为鼻塞、瘙痒、鼻漏以及阵发性喷嚏，气流阻塞等，该疾病影响着世界上大约30%的群众，一般发生于儿童时期，是儿童最常见的慢性过敏性疾病。lncRNAs在调控Th2反应中的作用研究提示其可能在AR的发病机制中发挥重要作用。

有研究者对AR患者鼻黏膜中的lncRNA进行基因芯片检测分析，发现其中有1 033个lncRNAs在鼻黏膜组织中高表达，有1 226个lncRNAs低表达。对lncRNA-mRNA共表达进行分析发现，这些差异表达的lncRNAs在AR发育相关的细胞信号通路中富集，例如能够促进IL-13产生，正向调控免疫球蛋白受体FcεR-1和核因子κB(nuclear factor kappa B，NF-κB)信号通路[15]。另外，对AR患者外周血进行基因芯片分析[16]，发现有31个lncRNA存在差异表达，通过qRT-PCR验证，ENST00000445003.1、ENST00000456563.1 和ENST00000609268.1 在AR患者中显著高于对照组。GO、Pathway和Disease分析表明，这3个lncRNA与炎症、免疫反应和过敏性疾病方面富集的mRNA：色氨酰tRNA合成酶、调亡相关酪氨酸激酶、葡萄糖苷酶等密切相关。转录因子预测结果提示有机阳离子转运蛋白、转录激活因子AP-1及NF-κB在lncRNAs介导的AR发病机制中发挥关键作用。

有研究报道，lncRNA-ANRIL的表达水平与TNF-α、2型细胞因子IL-4和IL-13呈正相关，与IL-10和IFN-γ水平呈负相关[17]，且lncRNA-ANRIL的表达与AR的患病风险、严重程度以及炎症指标的增加呈正相关，提示其可作为AR的诊断指标。还有研究发现，阻断组蛋白去乙酰化酶(HDAC)活性可能成为AR的一种新治疗靶点，因为丁酸钠能够抑制HDAC，进而使lncRNA-NONMMUT057309表达下调，最终改变免疫球蛋白的表达。提示丁酸钠可能通过调控lncRNA-NONMMUT057309的表达影响鼻黏膜的过敏反应[18]。研究者在AR患者的鼻组织和IL-13刺激的鼻上皮细胞中发现lncRNA-00632表达下调。并且lncRNA-00632能够抑制IL-13诱导粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，嗜酸性粒细胞趋化因子和粘蛋白的产生，其作用机制是lncRNA-00632靶向miR-498进而调控下游炎症信号[19]。研究发现lncRNA-Forkhead box D3反义RNA1(lncRNA-FOXD3-AS1)在AR患者鼻黏膜中表达下调，抑制细胞中IL-25的分泌，从而减轻AR中Th2型免疫反应[20]。还有研究表明[21]，lncRNA-NEAT1及其靶点miR-21和miR-125a与AR患病风险、严重程度和炎症密切相关。

这些研究显示了不同的lncRNA在AR中的重要作用(Tab 1)，值得注意的是，lncRNA-ANRIL和lncRNA-NEAT1不仅在AR中过表达，在过敏性哮喘中也表达升高，虽然最终炎症因子均表现出升高，但其作用机制不同，同一个lncRNA在不同的疾病中可能通过调控不同的靶点miRNA发挥作用。目前关于lncRNA在AR中的研究主要集中于临床样本，在临床研究中发现不论是在鼻黏膜组织，还是在患者的外周血中，均存在lncRNAs的差异表达，这些差异表达明显的lncRNAs通过调控炎症因子发挥作用，其有可能成为AR评估的生物标志物或新靶点。但对于lncRNAs的机制研究尚不深入，仍需大量的动物实验以及细胞实验加以证明。

Tab 1 Expression and function of lncRNAs in allergic diseases

4 lncRNA在过敏性皮炎中的作用

特应性皮炎(atopic dermatitis，AD)以Th2细胞介导的异常炎症反应和血清IgE和嗜酸性粒细胞升高为特征，并伴随皮肤湿疹性皮肤破损和剧烈的瘙痒，AD患者更容易诱发其他过敏性疾病，很多患者在儿童时期患有AD，成年后对过敏原敏感性增加，其中有30%～60%患者伴随过敏性鼻炎和哮喘[22]。因此AD的发病机制以及诊疗策略的研究不容忽视。

目前，关于非编码RNA在AD中的研究，miRNA相对较多，其中lncRNA作为较新的领域，在AD中的作用研究较少，作者前期建立了异硫氰酸荧光素诱导的AD动物模型，利用基因芯片检测了该模型中lncRNA的表达。在AD复发后，发现5 766个lncRNA调控异常。且有419个lncRNA在炎症消退的缓解期仍然差异表达。进一步验证发现lncRNA0016+，uc008thl.1，uc029qxr.1和AK077345表达显著性上调。uc029ycn.1、ENSMUST00000164311和ENSMUST00000149791表达显著性下调。并对这几个具有显著性差异的lncRNAs进行靶基因的预测分析以及ceRNA分析[23]。这些lncRNAs可能是调节小鼠特应性皮炎复发的潜在新靶点(Tab 1)，其具体作用机制值得深入研究。

5 lncRNA是潜在治疗靶点

LncRNA在疾病中发挥着关键的作用，提示靶向干预特异性的lncRNA可能是治疗疾病的有效手段。lncRNA具有高组织特异性以及对细胞网络特定面的调节特点，以及其毒性作用弱等优势。并且lncRNA缺乏翻译过程，周转快，较低的剂量即可发挥快速的效果。因此lncRNA作为潜在的干预靶点在临床上备受关注。

目前，靶向lncRNA的治疗方法主要基于反义寡核苷酸(antisense oligonucleotides，ASOs)的使用。ASOs本质上是单链的DNA寡核苷酸，根据序列同源性和RNA的可能性，能够较快完成设计。并且ASO适用于靶向保留在细胞核中的lncRNA，这是因为ASO通过Watson-Crick碱基配对与目标RNA结合，并能在结合位点诱导核糖核酸酶H(RNase-H)介导的共转录裂解，导致过早转录终止，从而降低lncRNA水平。ASOs在细胞中有很高的疗效，但在临床使用中仍有一定局限性，主要是因为其在体内的毒性以及缺乏合适的传递系统，阻碍了足够剂量的治疗性ASOs对组织的靶向作用。为改善其药理活性，学者们对ASOs进行了一定的化学修饰，如GapmeR ASOs、RNA-DNA-RNA单链寡核苷酸链。这些修饰可增强与靶RNA的杂交亲和性，从而增加对核酸酶降解的抵抗力，并减少了非特异性免疫刺激活性。目前一些靶向mRNA的ASOs已经被FDA和欧洲药物管理局批准或进入临床试验，一些靶向致癌lncRNA的ASOs也在开发中[24]。

另外，也有一些研究使用小分子靶向lncRNA，进而发挥作用。但想要获得具有高亲和力和特异性结合lncRNAs的分子，需要识别结构复杂的相关RNA序列[25]。且lncRNA经常折叠成几个模块结构域，其可能参与不同的分子相互作用，因此此方法存在一定局限性。针对lncRNAs在疾病中的治疗和应用，有研究发现可以通过阻断lncRNA和蛋白质之间的相互作用从而达到治疗作用。还可通过采用模仿lncRNA结构和结合特性的合成分子竞争性与蛋白结合，从而干扰其功能。

除此之外，外泌体作为纳米微泡，可将核酸、蛋白质运送到受体细胞。结合外泌体没有肿瘤形成的风险，并且可以通过过滤消毒，很容易在体内循环并到达损伤部位且长期重复给药外泌体不会引起毒性等优点。利用外泌体携带特异性的lncRNA类似物/抑制剂或可与lncRNA结合的分子，进行过敏性疾病的靶向治疗可能是一种安全有效的手段，其具体作用和开发值得深入研究。

6 小结

在过去的几十年里，由于环境变化和表观遗传修饰等原因，过敏性疾病的发病率呈现惊人的增长趋势。目前临床上常用的治疗方式有糖皮质激素、抗组胺药、免疫抑制剂等，其主要在于控制症状，不仅对过敏性疾病的反复发作束手无策且其副作用较大。尤其对于很多中度或重度患者，以及对糖皮质激素不敏感患者，目前临床上缺乏较好的诊疗方案。因此对于过敏性疾病的防治研究一直是研究者关注的问题。虽然近年来对过敏原引起的免疫反应方面取得了一定进展，像一些生物制剂的开发使用，如靶向IL-4和IL-13信号的Dupilumab以及靶向胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)的Tezepelumab，均显现出治疗优势，但仍需多次给药来发挥疗效，且其安全性需要通过长期随访研究进一步证实。因此寻找新的替代治疗方式和干预措施，为患者选择最合适的药物十分重要。

中医药在过敏性疾病的治疗中存在明显优势，不仅副作用小，且对很多过敏性疾病的复发有抑制作用，像中药玉屏风散、防风通圣散等均表现出能够改善过敏微环境的特点。基于中药对非编码RNA的调控，揭示中药的有效物质基础，明确特异性靶点，对中药的作用机制的明确具有重要意义。因此靶向非编码RNA，包括miRNA或lncRNA是一种新的治疗途径，在临床上具有优势特征。因此评估特定lncRNA在过敏性疾病调控中的作用，以及lncRNA的靶基因及其参与调控的ceRNA网络，将有助于识别过敏性疾病的生物标志物，并为lncRNA在过敏性疾病中机制的明确以及临床新药的开发和利用提供依据。