黑水虻抗菌肽分离纯化及活性组分对HCT-8细胞的增殖抑制作用

冯 群，田 忠，高嘉敏，李笑驹，夏 嫱

0 引 言

结直肠癌(colorectal cancer, CRC)是临床当前难以治愈的肿瘤之一，是全球公认的第三大恶性肿瘤，其发病率和死亡率随着人类发展进程的增加而增长[1]，在全球范围内其疾病负担均持续加剧。目前，临床针对该疾病尚无特效根治方法，主要是以靶向治疗为主，目的是改善患者的病情，延缓肿瘤进展，然而常规化疗药物严重的毒副作用对患者造成了极大的身心伤害，并且癌细胞也可能对常规化疗药物不敏感或产生耐药性[2]。因此，如何提高CRC的治疗效果且有效缓解化疗耐药的问题已成为当今研究的热点[3]，现今，学者们已将抗肿瘤药物的研发转向天然产物领域，期望找到一种高选择性、高理想治疗指数的生物源性抗癌药物，有望推动迫在眉睫的CRC治疗现状。

抗菌肽是一类小分子多肽，具有抗细菌、抗真菌、抗病毒等微生物感染和介导炎性介质的释放及杀伤癌细胞等多种生物学功能[4]。其天然来源非常广泛，有细菌、植物、昆虫和鱼类等，昆虫作为地球上最多的群体，昆虫源抗菌肽无疑也是最丰富的[5]，并且其中超过55%的具备抑癌作用，结合抗癌肽独特而复杂的作用机制，以致于它们不仅可以选择性杀伤恶性细胞、还可避免产生对微生物和癌细胞耐药性，因此备受科研工作者们的关注。黑水虻(Black soldier fly，HermetiaillucensL.)作为一种与家蝇和黄粉虫齐名的双翅目水虻科(Stratiomyidae)腐生昆虫，全球范围广泛分布[6]，幼虫因长期于高浓度的病原体环境中的生存，自身形成了强大的免疫防御功能，即在血淋巴产生了大量的抗菌肽[7]。首次针对黑水虻来源抗菌肽的研究是在2013年[8]，该报道成功引起了学者们对黑水虻源肽的注意[9]。近年来，通过学者们的努力，黑水虻抗菌肽已在大肠埃希菌及毕赤酵母X-33中得到成功表达，并证实了其对革兰阳性菌、革兰阴性菌及真菌良好的抑菌活性[10]，与其他昆虫来源肽如cecropins、Bmattacin2、Defensins和Melittin等报道相一致[11-14]。然而，目前关于黑水虻抗菌肽抑癌活性的研究鲜有报道。本课题结合前期黑水虻抗菌肽对鼻咽癌CNE2细胞和结肠癌HCT-8细胞均具有抑制作用，且对正常红细胞不溶血的基础上[15]，进一步探讨黑水虻抗菌肽活性组分对HCT-8细胞增殖抑制的作用机制，希望能为其后续在CRC药物治疗方面的应用提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料黑水虻抗菌肽粗提物(课题组由黑水虻5龄幼虫血淋巴提取获得)；乙腈(北京化工厂)；三氟乙酸(北京化工厂)；LB培养基(广东环凯生物科技有限公司)；RPMI-1640培养基(GIBCO 公司)；DMEM培养基(GIBCO 公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；CCK-8试剂盒(日本同仁公司)。

1.2供试细菌及细胞株大肠埃希菌(NCTC12900)、金黄色葡萄球菌(ATCC25923)购自南京兴润生物技术有限公司；结肠癌细胞(HCT-8)和正常人胚肾细胞(HEK293)标准株均购于中国科学院上海ATCC细胞库。

1.3仪器高效液相色谱仪(RD-JY-030，日本岛津公司)；超净工作台(SW-CJ-2FD，苏净集团安泰公司)；电热恒温培养箱(JC303，上海成顺仪器仪表有限公司)；CO2培养箱(HF90/HF240，力康生物医疗科技控股有限公司)；全波段酶标仪(Multiskan Go，Thermo公司)；流式细胞仪(CyFlow Cube，德国Partec公司)。

1.4实验方法

1.4.1 黑水虻抗菌肽分离纯化先将黑水虻抗菌肽粗提物通过相对分子量为10 000及3000超滤离心管，将离心后获得的抗菌肽粗提物利用分析型RP-HPLC进行分离纯化，色谱柱型号 ODS-C18，规格：10 mm×150 mm,10 μm，色谱条件：先用0.1%TFA平衡色谱柱；流动相A: 超纯水(含0.1%TFA)，流动相B: 80%乙腈(含0.1%TFA)，进样量10 μL，检测波长214 nm，流速1 mL/min，柱温21 ℃。按照出峰时间收集各峰所对应的组分。

1.4.2黑水虻抗菌肽活性组分筛选将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌配制成3.2×1012个/mL浓度的菌液，各吸取50 μL放于制备好的LB固体培养基中，用涂布棒均匀涂布，待菌液干后，向接好菌的培养皿中放入直径为6 mm的无菌纸片，每组4个重复，每个培养皿设阳性对照组(硫酸庆大霉素)、阴性对照组(等渗盐水)和实验组(组分HI-1、HI-2、HI-3)，实验组在纸片上加25 μL各组分，阴性对照组加等体积的等渗盐水；将培养皿做好标记,放入37 ℃培养箱培养24 h，观察并测量抑菌圈的大小。

1.4.3红细胞溶血率检测在96孔板中分别加入50 μL 2%以等渗盐水配制的豚鼠红细胞悬液，再分别向实验组加入50 μL以等渗盐水配制浓度分别为62.5、125、250、500和1000 μg/mL的抗菌肽HI-3，阴性对照组加入等量等渗盐水，阳性对照组加入等量纯水，每组设4个重复。放入培养箱中孵育1 h，取出后1000×g离心5 min，吸60 μL上清至新的96孔板中，利用酶标仪测定414 nm处吸光度(A)值，溶血率计算公式：

溶血率(%)=(A(实验孔)-A(阴性孔))/(A(阳性孔)-A(阴性孔))×100

1.4.4增殖抑制率检测取对数期HCT-8和HEK293细胞，胰蛋白酶消化，制成浓度为7×104个/mL的细胞悬液。将细胞悬液以100 μL/孔接种于96孔板，培养箱继续培养24 h，显微镜观察细胞状态，待贴壁后吸出原培养基，向各实验孔中加入100 μL抗菌肽活性组分HI-3溶液，浓度分别是100、200、400 μg/mL，阴性对照组加入等量常规培养基，每组设4个重复，继续培养24 h。干预24 h后，向每孔各加入10 μL CCK-8反应试剂，放于培养箱继续孵育1.5 h，酶标仪测定每孔细胞在波长490 nm处的A值，并分别计算HI-3对癌细胞及正常细胞的增殖抑制率，计算公式如下：

抑制率(%)=[A(阴性对照组)-A(实验组)]/A(阴性对照)×100

1.4.5细胞周期检测按1.4.4 方法重悬细胞，将HCT-8细胞悬液以2 mL/孔接种于6孔板，培养24 h，待细胞贴壁后弃去原培养基，向培养板中加入1.5 mL以5% FBS培养基配制的抗菌肽HI-3溶液，浓度同1.4.4，以不加HI-3的培养基为对照。继续培养36 h，吸出原培养基至15 mL离心管中，PBS洗涤细胞。吸取300 μL不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞，179×g离心3 min，弃上清。用预冷的PBS重悬细胞，离心并制备细胞悬液。将细胞悬液加至有1 mL预冷的70%乙醇的试管中，固定细胞。将固定后细胞离心，去除乙醇，再加入500 μL预先配好的染色液，室温避光反应30 min，流式细胞仪检测。

2 结 果

2.1 黑水虻抗菌肽粗提物分离纯化将课题组提取所得抗菌肽粗提物用分析型RP-HPLC进行分离纯化，见图1。色谱图中有3个分离度较好的色谱峰，分别命名为HI-1、HI-2和HI-3，按照出峰时间，分离纯化洗脱峰HI-1、HI-2、HI-3对应组分，并真空冷冻干燥，于-40℃保存备用。

图1 黑水虻抗菌肽粗提物RP-HPLC分析结果

2.2黑水虻抗菌肽活性组分筛选利用药敏纸片法筛选抗菌肽活性组分。组分HI-1、HI-2对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌均未表现出抑菌作用，与阴性对照比较差异无统计学意义(P>0.05)。然而，组分HI-3对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌均表现出良好的抑菌活性,与HI-1、HI-2及阴性对照相比显著增加(P<0.05)；但HI-3对金黄色葡萄球菌及大肠埃希菌的抑菌活性差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 组分HI-1、HI-2、HI-3的抑菌活性

2.3抗菌肽活性组分HI-3对红细胞溶血性的影响由图可以看出，抗菌肽 HI-3对豚鼠正常红细胞几乎不溶血，当HI-3的浓度达500 μg/mL时，溶血率达最大，仅为(0.16±0.07)%，与其他浓度处理组和阴性对照组(等渗盐水)相比差异无统计学意义(P>0.05)。见图2。

图2 抗菌肽HI-3对红细胞影响

2.4抗菌肽活性组分HI-3对对HEK293和HCT-8细胞增殖的影响不同浓度的活性组分HI-3对HEK293细胞增殖的影响均较小，当浓度为400 μg/mL时，抑制率达到最大仅为(11.24±0.05)%，与其他浓度处理组相比差异无统计学意义(P>0.05)。然而，HI-3对HCT-8细胞增殖的影响则比较显著，其抑制率随着HI-3处理浓度的增加而增大，当HI-3浓度达50 μg/mL及以上时，与同浓度处理组HEK293细胞的抑制率相比差异具有统计学意义(P<0.01)；当HI-3处理浓度达到400 μg/mL时抑制率达最大，为(60.11±0.75)%，明显高于其他浓度处理组(P<0.01)。见图3。

与相同浓度HI-3处理后的HEK293细胞比较，*P<0.05、**P<0.01

2.5抗菌肽活性组HI-3对HCT-8 细胞周期的影响流式细胞仪检测抗菌肽HI-3对HCT-8 细胞周期的影响，结果见图4和表2。随着抗菌肽HI-3处理浓度的增加，HCT-8细胞在G0/G1期的比例明显增加，在400 μg/mL浓度时达到最大，为(63.53±0.62)%；G2/M期的细胞比例随处理浓度的增加明显减小，变化呈现明显的浓度依赖性；S期细胞的比例在低浓度(0～200 μg/mL)增大，高浓度(400 μg/mL)时减小，呈现先增加后下降的变化趋势。说明抗菌肽HI-3在低浓度时阻滞HCT-8细胞于G0/G1期和S期，高浓度仅阻滞HCT-8细胞于G0/G1期，提示抗菌肽HI-3可能是通过影响DNA 的复制和有丝分裂，进而影响HCT-8细胞的增殖。

a: 0 μg/mL; b: 100 μg/mL; c: 200 μg/mL; d: 400 μg/mL

表2 抗菌肽HI-3对HCT-8 细胞周期的影响

3 讨 论

近年来，随着人们对天然AMP作为潜在新药的兴趣日益浓厚[16]，国内外已有许多针对抗菌肽抗癌活性的研究，且这些抗癌肽大多具备细胞选择性，对正常宿主红细胞不溶血，无毒物蓄积等特性；如Wang等[17]报道temporin-1 CEa 对乳腺癌细胞具有不同程度的抑制作用，而对正常人红细胞和人脐静脉平滑肌细胞无明显抑制作用；Abdel-Salam等[18]首次证实了阳离子α螺旋抗菌肽LyeTxI-B具有对胶质母细胞瘤U87-MG的毒性作用，但对人正常成纤维细胞无毒副作用；Abbas等[19]的研究也显示阳离子嵌合肽cLFcHI-3mera对软骨肉瘤和大肠癌细胞具有较强的杀伤作用，但对正常细胞杀伤作用较弱。本研究结果亦表明，黑水虻抗菌肽活性组分HI-3对HCT-8细胞的抑制作用显著，且对豚鼠红细胞及正常HEK293细胞无明显作用，与前面所列举研究结果相一致，表明抗菌肽HI-3同样具有良好的药用开发潜力，也将会是临床常规化疗药物不可比拟的。

研究表明，抗菌肽通过不同的机制发挥作用,如胶束化、纳米结构的自组装和膜孔的形成以及细胞周期的阻滞等等，其中，细胞周期包括分裂期(M期)和间期(G1、S、G2期)，每个时期都与肿瘤的发生发展密切关联，任何一个时期出错，均可能影响肿瘤细胞的增殖与分化过程。迄今为止，已相继有大量关于抗菌肽作用细胞周期的报道，如天蚕素cecropinXJ阻滞肝癌Huh-7细胞于S期，以剂量和时间依赖的方式抑制其生长[20]；抗菌肽17BIPHE2亦阻滞A549细胞于S期，诱导该细胞发生凋亡[21]；Cecropin则通过上调周期调控蛋白CHK1和CDK2的表达，联合阻滞细胞周期于S期，进而影响人乳腺癌MCF-7细胞DNA的合成，间接发挥抗肿瘤的效应。家蝇抗菌肽MLL-2作用MCF-7细胞时，阻滞细胞周期于G2/M期[22]；而家蝇抗真菌肽-1A (MAF-1A)作用人肝癌HepG2细胞、家蝇胚胎细胞抗菌肽作用白血病K562细胞和抗菌肽Hymenochirin-1B作用肺腺癌A549细胞则均是通过停滞周期于G0/G1期发挥作用[23-25]。然而，本实验结果则显示：抗菌肽HI-3在低浓度(≤200 μg/mL)处理时，阻滞HCT-8细胞周期于G0/G1期和S期，在高浓度(400 μg/mL)处理时，仅阻滞HCT-8细胞周期于G0/G1期，提示抗菌肽HI-3可能在细胞分裂间期通过影响HCT-8细胞的DNA复制和相关蛋白合成，从而抑制其细胞增殖。但由于本研究仅是体外的初步研究，是否如此，具体机制如何，还需进一步深入研究。

在这项研究中，尽管黑水虻抗菌肽表现出了良好的研究价值和应用前景，但要将其转化为临床，前方仍然有一条慢长的路要走。原因主要有黑水虻抗菌肽天然提取难度极大，分离纯化后抗菌肽活性不高及后续溶解度低等问题[26]，已严重阻碍了本抗菌肽的进一步研究，以使得我们的研究至今还停留在基础实验阶段。若要进一步深入研究黑水虻抗菌肽的具体作用机制，首先第一步就是要保证活性的同时实现抗菌肽的大规模工业化生产[27]，并解决溶解度低等问题。届时，黑水虻抗菌将是抗肿瘤药物的最佳且有效的替代品，继而为人类的健康保驾护航。