基于LPS/TLR4信号通路探讨酒精性肝病大鼠疾病进展的相关机制

杨 玲，周素芳，路月红，王 莉

0 引 言

近年来，中国酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)的发病率上升[1]。过量饮酒可导致ALD，并诱发广泛的肝病变，从单纯性脂肪变性进展为脂肪性肝炎，再到肝纤维化、肝硬化,甚至肝癌。轻度ALD患者通常是无症状的，仅表现为一定程度的脂肪变性，戒酒后可逆转；然而，对于严重程度的ALD患者和那些没有实现戒酒的患者，迫切需要特效药物治疗[2]。ALD发病机制尚未明确，找到疾病进展的关键靶点具有重要意义。

现代医学针对ALD发病机制提出了“肠-肝轴”学说和“二次打击”学说，两者关系密切。“肠-肝轴”学说认为肠损伤与肝损伤相互作用，肠道屏障破坏导致肠源性脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)进入门静脉系统，激活肝Kupffer细胞等，释放一系列炎症介质，造成肝损伤；同时，肝免疫损伤释放的各种炎症介质通过体循环到达肠道，进一步损伤肠屏障功能[3]。根据“二次打击”学说，乙醇作为初次打击通过诱导氧化应激反应直接导致肝损伤[4]；“二次打击”是乙醇诱导的肠道屏障损伤导致LPS入血，激活肝免疫系统并释放炎症介质，进一步加重肝损伤[5-7]。两种学说在ALD发生、发展中的作用已日益受到重视[8-12], 成为目前研究的新趋势。两种理论均强调LPS入血造成肝免疫损伤及炎症反应是ALD发病的关键一步。本研究采用ALD大鼠模型，依据“肠-肝轴”学说和“二次打击”学说，探讨ALD疾病进展的相关机制，并揭示ALD治疗干预的潜在靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物清洁级SD大鼠80只，雌雄各半，6周龄，由江苏省南通大学实验动物中心提供。实验动物合格证号：SCXK(苏)2014-0001。大鼠饲养温度为20～26 ℃，湿度控制在50%～60%，光照与黑暗交替(各12 h)，自由饮水及进食。

1.2实验主要试剂及仪器56%乙醇购自北京红星酿酒股份有限公司；D-乳酸测试盒购自南京建成生物工程研究所(批号：A109-2)；二胺氧化酶(DAO)测试盒购自南京建成生物工程研究所，批号：A088-2；脂多糖(LPS)测试盒购自南京建成生物工程研究所(批号：A054)；Rat IL-1 ELISA Kit购自eBioscience Technology 公司(批号：100527031)； Rat TNF-αELISA Kit购自eBioscience Technology 公司(批号：100335038)； Rat IFNγ ELISA Kit购自eBioscience Technology 公司(批号：96-900-M109)；小肠黏膜 sIgA ELISA Kit购自eBioscience Technology 公司(批号：100235034)； 谷草转氨酶(AST)测试盒购自长春汇力生物科技有限公司(批号：A002)；谷丙转氨酶(ALT)测试盒购自长春汇力生物科技有限公司(批号：A001)；Beyozol购自碧云天(批号：R0011)；AccuRT Genomic DNA Removal Kit购自abm(批号：G488)；oneScriptTMcDNA Synthesis Kit购自abm(批号：G234)；EvaGreen Express 2X qPCR MasterMix-ROX abm MasterMix-ER购自abm(批号：MasterMix-ER)。

台式高速离心机(SCILOGEX D2012)；实时荧光定量PCR检测系统(天隆 TL988-IV)；PCR仪(SCILOGEX TC1000-G )；Thermo MK3酶标仪(美国热电公司)；TS-1型脱色摇床(江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。

1.3方法

1.3.1 分组、造模及给药将80只大鼠随机分为正常组、ALD组、LPS阻断组、TLR4阻断组，每组20只。ALD组、LPS阻断组、TLR4阻断组均需要建立ALD动物模型,具体参照文献 [13]，采用乙醇混合液[56%乙醇5 g/(kg·d)、玉米油2 mL/(kg·d)、吡唑27.2 mg/(kg·d)]灌胃建立ALD大鼠模型，1次/d；正常组每天灌服等容量的蒸馏水1次。各组大鼠均自由饮水，普通大鼠饲料喂养，连续12 周。在造模同时给药，LPS阻断组予MP12(5 mg/kg)静脉注射，1次/周，连续12周；TLR4阻断组予NBP2(500 μg/kg)皮下注射，1次/d，连续12周。末次给药后大鼠禁食不禁水12 h，称体质量，腹主动脉采血，分离血清和血浆，-80 ℃保存；解剖后，提取肠系膜淋巴结、肝及小肠组织，-80 ℃保存。

1.3.2血清ALT、AST检测全自动生化分析仪测血清ALT、AST水平，采取标本后按全自动生化仪操作规程进行。

1.3.3血浆二胺氧化酶、D-乳酸、LPS检测按照试剂盒说明书测定大鼠血浆二胺氧化酶、D-乳酸、LPS水平。

1.3.4小肠黏膜sIgA测定取完整小肠纵行剖开，反复冲洗肠腔，玻片轻刮肠腔表面,滴管定量吸取刮取物0.1 mL加入115 mL磷酸盐缓冲溶液充分混匀，反复低温离心后取上清，ELISA法检测小肠黏膜sIgA。

1.3.5组织培养法检测细菌易位取肠系膜淋巴结0.5 g，匀浆后作细菌培养。37 ℃孵育48 h，如果培养基平皿菌落数多于100个/g组织记为细菌培养阳性。

1.3.6血清TNF-α、IL-1和IFNγ检测采用ELISA法检测大鼠血清TNF-α、IL-1 和 IFNγ含量，检测操作严格遵从说明书执行。

1.3.7RealtimeQ-PCR测TLR4、MyD88、TRIF、IKK、P38、IRF3、NF-κB基因表达取各组大鼠肝组织50 mg匀浆处理后，经4 ℃，10000 r/min，离心10min，弃去上清。经洗涤沉淀、充分溶解，提取总RNA。RNA逆转录为cDNA，以 cDNA产物为模板,用Real time Q-PCR 测TLR4、MyD88、TRIF、IKK、P38、IRF3、NF-κB基因表达。根据引物进行扩增，引物序列见表1。反应条件：95℃预变性10 min，95 ℃变性5 s(重复40个循环)，60 ℃退火及延伸30 min(重复40个循环)；再于60～95 ℃，持续5 s，分析熔解曲线。采用软件分析阈值与Ct值。

1.3.8Western印迹法测TLR4、MyD88、TRIF、IKK、P38、IRF3、NF-κB蛋白表达取-80 ℃冻存的肝组织50 mg匀浆，加400 μL单去污剂裂解液，充分裂解30 min后，在4 ℃下12000 r/min离心5 min，取上清液；提取细胞质溶胶中总蛋白，BCA法对样品蛋白质定量。取蛋白样品经煮沸变性5 min、冰浴5 min后，进行SDS变性10%聚丙烯酰胺凝胶电泳。通过转膜将蛋白转移至硝酸纤维素膜上形成印迹，用含5%脱脂奶粉室温摇动封闭1 h。将膜置于含对应一抗的Blotto中，4 ℃摇动过夜。TBST洗膜4次，每次5 min。加入含对应二抗(HRP标记兔抗鼠和羊抗兔IgG抗体) Blotto中，室温作用1.5 h，再洗膜。将膜先后置于显色剂、曝光盒后进行显影，用LabWorksTM凝胶成像及分析系统进行摄像，分析各条带亮度值。

2 结 果

2.1 各组大鼠血 ALT、AST 比较ALD组大鼠血中ALT、AST表达量较正常组、LPS阻断组、TLR4阻断组显著升高(P<0.01)，见表2。

表2 各组大鼠血中 ALT、AST 水平比较

2.2各组大鼠血浆D-乳酸、LPS 和 DAO 的比较ALD组大鼠血浆D-乳酸、LPS和DAO较正常组、TLR4阻断组显著升高(P<0.05)，LPS阻断组D-乳酸、DAO表达较ALD组显著降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组大鼠血浆D-乳酸、LPS 和 DAO的比较

2.3各组大鼠小肠肠黏膜SIgA的比较ALD组大鼠小肠黏膜 SIgA[(168.67±18.38)pg/mL] 较正常组[(535.66±61.81)pg/mL]、TLR4 阻断组[(478.18±42.30)pg/mL]显著下降(P<0.01)，LPS 阻断组大鼠小肠黏膜 SIgA [(303.65±129.64)pg/mL]较ALD组显著升高，但差异无统计学意义(P>0.05)。

2.4各组大鼠肠系膜淋巴结细菌量检出数的比较ALD组大鼠肠系膜淋巴结细菌量检出数[(248±28)个]较正常组[(0±0)个]、LPS阻断组[(25±8)个]、 TLR4 阻断组 [(18±6)个]明显升高(P<0.01)。

2.5各组大鼠血清 TNF-α、IL-1、IFNγ的比较ALD组大鼠血中炎症因子TNF-α、IL-1表达较正常组、TLR4阻断组显著升高(P<0.01)， LPS阻断组IL-1表达较ALD组明显降低(P<0.05)。见表4。

表4 各组大鼠血清 TNF-α、IL-1、IFNγ比较

2.6各组大鼠肝组织TLR4、MyD88、IKK、P38、NF-κB、TRIF、IRF3基因表达ALD大鼠中TLR4、MyD88、IKK、P38、和NF-κB基因表达增强，予 LPS 和TLR4 阻断剂后上述基因表达量受到抑制(P<0.05)；TRIF、IRF3基因各组差异不显著。见图1。

与ALD组比较，*P<0.05、**P<0.01

2.7各组大鼠肝组织TLR4、MyD88、IKK、P38、NF-κB、TRIF、IRF3蛋白表达ALD大鼠中 TLR4、MyD88、IKK、P38和 NF-κB 蛋白表达增强，使用 LPS 和 TLR4 阻断剂后上述蛋白表达量受到抑制；TRIF、IRF3 蛋白表达在各组间差异不显著。见图2。

1：正常组；2：ALD组；3：LPS 阻断组；4：TLR4 阻断组

3 讨 论

ALD发病机制复杂，涉及多种途径。“肠-肝轴”学说认为酒精性肠损伤与肝损伤相互作用[3]，形成一个自我延续的恶性循环。“二次打击”学说提出乙醇作为“初次打击”直接导致肝损伤[4]，ALD的“二次打击”是乙醇破坏肠道屏障使LPS入血引起的[5-7]。两种理论关系密切，均强调LPS入血造成肝脏免疫损伤及炎症反应是ALD发病的关键一步。

乙醇影响肠道屏障的多层防御[14-16]，包括生理、体液和免疫成分[17]。酒精滥用破坏肠道屏障从而增加肠道通透性[18-19]，使大量肠道细菌产生的LPS得以进入门静脉循环[20-21]。进入门静脉血后，LPS被肝Kupffer细胞等细胞上表达的TLR4识别[22-23]。虽然TLR4不能直接与LPS结合，但其共同受体CD14和髓样分化蛋白2与LPS结合，并在与LPS结合后激活TLR4[24]，启动LPS/TLR4信号通路。LPS/TLR4信号通路的启动导致衔接分子髓样分化因子88(MyD88)和TRIF的募集，它们分别激活LPS/TLR4信号通路的两条下游途径，不同下游途径产生不同的炎症因子[25-26]。衔接蛋白MyD88承接MyD88依赖途径，该通路被激活后，活化后的MyD88进一步激活通路内关键调节蛋白，经过一系列细胞内信号传导,导致IKK磷酸化，进而激活NF-κB[27]。活化的NF-κB转位入核启动炎症因子基因表达, 最终导致TNF-α、IL-1等炎症因子释放[28]。衔接蛋白TRIF联接MyD88独立途径，该通路被激活后，随即激活IRF3使其磷酸化[29]。活化的IRF3调节炎症因子的转录表达，导致IFN等促炎性细胞因子的产生[30-31]。LPS/TLR4信号通路激活后产生大量炎症因子，最终触发肝内炎症反应参与ALD的发病。

本实验成功复制了ALD大鼠模型。实验发现，ALD大鼠肝损伤与肠屏障损伤同时存在。酒精可致ALD大鼠肝损伤，表现为肝细胞破坏，血清AST、ALT 升高。同时，酒精可致大鼠肠黏膜机械屏障损伤，表现为肠壁通透性增加，血浆D-乳酸、二胺氧化酶和LPS升高；酒精可致肠道免疫屏障损伤，表现为小肠黏膜分泌型 SIgA 减少；酒精可致肠道生物屏障损伤，肠道细菌易位，肠系膜淋巴结细菌检出数增加。肠道屏障损伤导致LPS入血激活LPS/TLR4信号通路，释放炎症因子，导致肝免疫性损伤。本实验中，ALD大鼠血中TNF-α、IL-1较正常组显著性升高，TLR4、MyD88、IKK、P38和NF-κB基因和蛋白表达增强，而各组IFNγ无显著性差异，TRIF、IRF3基因和蛋白表达各组差异不大，提示LPS/TLR4信号通路的下游途径中MyD88依赖途径参与了ALD发病的过程，MyD88独立途径可能没有参与ALD的发病。当给予ALD大鼠LPS阻断剂(MP12)和TLR4阻断剂(NBP2)后，结果显示，两种阻断剂能有效地阻断LPS/TLR4 信号通路，在相关因子TLR4、MyD88、IKK、NF-κB、TNF-α、IL-1表达减少的同时，ALD 大鼠的肠屏障及肝损伤均好转，提示LPS/TLR4 信号通路高表达，相关因子TLR4、MyD88、IKK、NF-κB、TNF-α、IL-1表达或释放，是酒精致肠屏障及肝脏损伤的重要机制。

本实验证实酒精损伤肠屏障，激活LPS/TLR4信号通路，导致肝免疫性损伤，是酒精性肝损伤的重要分子机制。同时，实验还发现，酒精导致肠屏障损伤，其直接损伤作用似乎并不严重，而由于直接损伤后导致 LPS/TLR4 信号通路表达增强， 介导肠屏障受到免疫性“二次打击”，可能是肠屏障损伤更为重要的机制。肠屏障也如肝脏一样，可受到“二次打击”，并且“二次打击”对肠屏障造成的损伤更为重要，肠屏障的“二次打击”也同样由LPS/TLR4信号通路所介导，这从另一角度丰富了“肠-肝轴”学说。

综上所述，乙醇本身并不是ALD疾病进展的唯一原因，ALD的发生、发展是一个多步骤、多层次的过程。本研究初步证实LPS/TLR4信号通路激活是ALD疾病进展的关键环节，该信号通路可成为ALD治疗的潜在靶点。但是,信号转导通路错综复杂，而目前研究涉及的指标尚不能全面地反应LPS/TLR4信号通路在ALD发病中的作用，其有关机制值得进一步证实及深入研究。