匹立尼酸对肝癌经导管动脉栓塞术后癌旁肝组织炎症及肿瘤血管生成的作用

熊文翠，杜 伟，李正亮，杨培鈺

0 引 言

据 《全球癌症报告》记载，全球每年报告84.1万例肝细胞癌病例，其中约78.1万人死于肝细胞癌[1]。目前，手术切除仍是肝癌治疗的首选，但80%以上的患者确诊时已无法手术，5年生存率仅10%左右[2]。经导管动脉栓塞术(transcatheter arterial embolization,TAE)是无法手术治疗的中晚期肝癌患者的首选，但其3年生存率仅有14%～30%，这与TAE术后肿瘤缺血缺氧并分泌大量促血管生成因子有关[3]，而新生血管生成是肿瘤生长和转移的病理基础，故TAE术无法达到根治的效果。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前特异性最强的促血管生成因子，与肿瘤新生血管的生长密切相关[4-5]，并能改变血管通透性，刺激肿瘤血管内皮细胞持续增殖，影响肝癌患者的生存及预后。同时，本课题前期研究发现，肝癌TAE术后癌旁肝组织中过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator-activated receptor α, PPARα)表达下降，核因子-κB (nuclear factor kappa B, NF-κB)表达升高并促进了炎性因子TNF-α、IL-10产生，加重了癌旁肝组织肝功能损伤[6-7]。PPARα来自核受体PPAR家族(PPARα，PPARδ和PPARγ)，是能量代谢的主要转录调节因子，在肝、肾和心脏等多个器官中表达，可调节葡萄糖和脂质代谢稳态且对调节炎症和血管生成起着重要作用[8]。匹立尼酸(Pirinixic acid, WY14643)是一种新型的人工合成PPARα激动剂，能激活PPARα下调与免疫途径相关的各种基因[9]，抑制炎症反应，缓解肝功能损伤。Zhang等[10]研究发现WY14643能下调VEGF的表达，抑制新生血管生成。NF-κB是细胞变性坏死及炎症产生的关键启动因子，能调控下游的炎性因子及黏附因子，推动炎症的进展[11]。本研究拟通过观察匹立尼酸预处理后的VX2肝癌模型兔癌旁肝组织中PPARα、NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1及肿瘤组织中VEGF水平变化，探讨匹立尼酸保护癌旁组织肝功能及抑制肿瘤复发转移的作用，以期为肝癌患者TAE术后预后提供重要的临床参考。

1 材料与方法

1.1 实验对象选取VX2荷瘤兔2只(由东南大学附属中大医院惠赠)，70只健康新西兰大白兔购买于昆明楚商科技有限公司，动物许可证号：SCXK(滇)K20180001，体重2.5～3.6 kg，雌雄不限，营养状况一致，普通饲料喂养。动物实验按照SPF级要求饲养，室内温度20～25℃，相对湿度40%～70%，换气次数10～15次/h，空气洁净度10 000级，自由进食进水。

1.2实验分组及处理方法通过传代及瘤粒注射法构建肝癌兔模型[6-7]，共成功建模60只，随机分为：对照组(不作任何处理)、TAE组(仅行TAE术)、联合治疗组[TAE术前3 d连续耳缘静脉注射匹立尼酸(剂量：3 mg/kg·d)，后行TAE术]，每组20只。

1.3肝功能检测及实验标本取材与保存术前3 d及模型兔处死前分别抽取3组外周血，分离血清，分装进Eppendorf管(EP)做好标记，部分用于检测丙氨酸转氨酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)水平，部分存于-20 ℃备用，具体操作步骤按照说明书进行。TAE术后3 d将实验兔处死，取其癌旁组织，参考“7点”基线取材法[12]，取距肿瘤边缘>2 cm的癌旁肝组织，等渗盐水漂洗，液氮速冻并做好标记后存于-80℃冰箱备用。

1.4免疫组化法检测PPARα及NF-κB表达水平癌旁组织固定后用石蜡包埋并切片，石蜡包埋标本，切片后用免疫组化法检测PPARα、NF-κB，具体步骤按说明书进行。由两名病理医师独立评估结果，取平均值。每张切片于400倍镜下选取10个视野，依据细胞阳性表达比例和蛋白表达部位阳性信号的强度进行综合评分。细胞阳性表达比例计分：阳性细胞比例<5%为0分， 5%～25%为1分，25%～50%为2分，>50%为3分；阳性信号强度计分：细胞无染色为0分，淡黄色为1分，黄棕色为2分，深棕色为3分。将细胞阳性评分和阳性信号强度评分之和，作为判定结果的标准：阴性(-)为<2分，弱阳性(+)为2～3分，阳性(2+)为4～5分，强阳性(3+)为6～7分[6]。

1.5 ELISA法检测TNF-α、ICAM-1、VCAM-1及VEGF蛋白水平采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测标本中TNF-α、抗细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)及VEGF蛋白水平，具体步骤按说明书进行。

1.6 RT-PCR检测PPARα、NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1及VEGF mRNA 表达水平取各组模型兔适量组织制备各组癌旁肝组织匀浆，通过TRIzol法提取总mRNA，测定其光密度(A)值，计算出RNA纯度和浓度，严格按照试剂盒实用说明进行逆转录、RT-PCR反应，PPARα引物序列上下游分别为：5′-CACCATCCACTTCGAGCAGA-3′,3′-GTCACATTCCCAGGTCGCC-5′；NF-κB引物序列上下游分别为：5′-ACTTCCTGGCGCATCTAGTG-3′,3′-CATGTCCTTGGGTCCAGCAT-5′；TNF-α引物序列上下游分别为：5′-GGGTATCCTTTCGACGGCAA-3′,3′-GGCGTTTCCAAAGTACGTGG-5′；ICAM-1引物序列上下游分别为：5′-CAGATGGCTCCGTGATCACAG-3′,3′-ACCAGCTTTAGCCGAATCGTTC-5′；VCAM-1引物序列上下游分别为：5′-CAGACACGGTGGAGCAGATC-3′,3′-AAGACTACCAAGCCGCTGAC-5′；VEGF引物序列上下游分别为：5′-TGGACAAACCTGAGCCCTAAC-3′,3′-TCACTTTCTGCAGGCCAAGT-5′。扩增条件：①95 ℃，10 min；②95 ℃，15 s；60 ℃，20 s；72 ℃，25 s；40个循环；③72 ℃，5 min。采用相对定量法(2-△△CT法)分析mRNA的相对表达含量。

2 结 果

2.1 肝功能指标ALT、AST变化水平3组模型兔间术前外周血中ALT、AST水平差异无统计学意义(P>0.05)；术后联合治疗组ALT、AST水平明显高于对照组(P<0.05)，低于TAE组(P<0.05)。见表1。

表1 模型兔术前术后肝功能功能检测比较

2.2免疫组化法检测PPARα、NF-κB表达水平免疫组化分析显示，PPARα在联合治疗组中阳性率高于对照组、TAE组(P<0.05)；NF-κB在联合治疗组癌旁肝组织的阳性率显著低于TAE组(P<0.05)。见表2。

表2 癌旁肝组织中PPARα、NF-κB免疫组化结果

2.3ELISA法检测TNF-α、ICAM-1、VCAM-1及VEGF蛋白水平联合治疗组TNF-α、ICAM-1、VCAM-1及VEGF含量显著低于TAE组(P<0.05), TAE组TNF-α、ICAM-1、VCAM-1及VEGF含量显著高于对照组(P<0.05)。见表3。

表3 TNF-α、ICAM-1、VCAM-1及VEGF蛋白水平

2.4RT-PCR检测PPARα、NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1及VEGF mRNA 表达水平联合治疗组PPARα、NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1及VEGF含量显著低于TAE组(P<0.05), TAE组PPARα、NF-κB、TNF-α、ICAM-1、VCAM-1及VEGF含量显著高于对照组(P<0.05)。见图1。

*P<0.05

3 讨 论

临床上约90%行TAE治疗的HCC患者已是中晚期并伴有不同程度的肝硬化，肝功能基本处于临界值状态[13]。本研究应用了WY14643的联合治疗组ALT、AST水平低于TAE组，表明WY14643具有保护肝功能的作用，与前期结果相符。因此，如何尽可能在保护肝功能前提下完成肿瘤栓塞成为肝介入治疗的重点。

本研究结果示，TAE术后肝癌组织中VEGF高于对照组及联合治疗组，与张国福[14]的结论相似；戴峰等[15]研究也提示TAE术后因不全栓塞、多侧支循环等因素，造成肿瘤不能完全凋亡坏死，在缺氧环境诱导下局部肿瘤组织产生VEGF，刺激肿瘤血管快速生成并持续增殖。此外，VEGF结合癌细胞膜受体，降低细胞间质黏附性，使癌栓分离脱落，促进肿瘤转移[16]。Yao等[17]研究结果提示，HCC中高表达的VEGF与肿瘤复发呈正相关，故抑制肿瘤血管生成对改善患者预后有重要意义。另已有研究表明，PPARα激动剂通过抑制肿瘤细胞分泌VEGF，上调内皮抑素的表达来阻碍肿瘤血管的生成从而抑制肿瘤生长[18-19]；结合本研究结果，联合治疗组中VEGF水平显著低于TAE组，由此推断，WY14643能在一定程度上抑制肿瘤组织VEGF的表达，从而减少肿瘤新生血管，降低肿瘤复发转移的几率。

炎症是肿瘤发生发展的重要因素，炎性指标在评估肝癌患者预后中有重要价值[20]。NF-κB是炎症和新血管形成的主要转录因子；未受刺激时，NF-κB与其抑制蛋白IκB-α结合形成复合体，以无活性状态储存在细胞质中，从而发挥抗炎作用[21]。TNF-α是一种多效性细胞因子，可激活NF-κB并促进NF-κB介导的炎症相关的抗凋亡因子转录[22]，从而产生炎症。Zhang等[23]发现，NF-κB能促进炎性因子表达，且NF-κB 和 TNF-α 之间的正反馈反应似乎会加重炎症和肝细胞损伤的程度。白细胞浸润是急性炎症的标志，主要由细胞黏附因子(如ICAM-1、VCAM-1等)介导[24]。Liang等[25]证实ICAM-1、VCAM-1及MCP-1的表达可由NF-κB来介导，而高表达的黏附因子会增强炎症细胞募集和黏附，加重炎症损伤。另Jing等[26]研究发现，通过下调NF-κB/TNF-α信号通路，减少炎性因子与黏附因子的表达，可保护细胞免受炎症损伤，这表明NF-κB的活性变化及其下游调控因子的表达与癌旁组织肝损伤变化具有明显的相关性。

Nakano等[27]及Tayyeb等[28]研究表明，PPARα 激动剂可通过负性调节 NF-κB 活化来抑制细胞因子诱导的炎症基因的激活，如VCAM-1、TNF-α和IL-6；其次，PPARα 激动剂还可通过调节抗氧化酶的活性，降低氧化应激，从而抑制NF-κB活化[29]。本研究结果显示，TAE组中NF-κB活性增强，TNF-α和ICAM-1、VCAM-1水平上升，加速细胞凋亡坏死，导致肝功能损坏；而经WY14643预处理后，NF-κB活性下降,TNF-α和ICAM-1、VCAM-1水平降低,减慢细胞凋亡坏死，缓解肝功能损伤，由此推测WY14643可通过活化PPARα，拮抗NF-κB转录活性，减少下游炎症基因表达，达到抗炎的目的。由此可见NF-κB与其下游的TNF-α、ICAM-1和VCAM-1之间是相互作用的，对于PPARα是否是通过抑制NF-κB表达来减少TNF-α、ICAM-1和VCAM-1的表达，还是PPARα分别对其有调节作用尚需要进一步实验验证，但至少本研究发现经WY14643预处理的实验组中NF-κB、TNF-α、ICAM-1和VCAM-1都不同程度下降，炎症得到了缓解。

肝癌通常发生在肝炎、肝硬化等慢性肝损伤基础上，慢性肝损伤引起的炎症微环境会促进肝硬化发展并激活癌旁组织中NF-κB、TNF-α等炎症介质，加速肝癌恶变[30-32]。结合本研究推测，WY14643可通过减轻肝损伤及炎症，一定程度上延缓肝硬化发展，有助于患者的预后评估。

综上所述，WY14643可通过上调PPARα表达，抑制NF-κB产生，减少TNF-α、ICAM-1和VCAM-1合成，从而减轻TAE术后癌旁肝组织炎症，同时抑制肿瘤细胞VEGF的表达来遏制肿瘤复发转移，为改善TAE术后患者生存预后提供新的指导意见。但本次研究的相关因子较表浅，且WY14643抑制肿瘤血管生成和改善炎症的调节机制比较复杂，还需进一步研究。