玉米种质资源抗腐霉茎腐病和镰孢茎腐病精准鉴定

段灿星，曹言勇，董怀玉，夏玉生，李红，胡清玉，杨知还，王晓鸣

1中国农业科学院作物科学研究所/农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程，北京 100081；2河南省农业科学院粮食作物研究所，郑州 450002；3辽宁省农业科学院植物保护研究所，沈阳 110161；4吉林省农业科学院植物保护研究所，吉林公主岭 136100

0 引言

【研究意义】玉米（Zea mays L.）是中国最主要的粮饲兼用作物，也是重要的工业原料和能源植物，在国民经济和农业生产中占有重要地位。2000年以来，中国玉米种植面积持续增长，2012年达3 910.9万hm2，总产量22 955.9万t，占谷物总种植面积和总产量的 40.26%和 40.52%，超越水稻成为中国第一大粮食作物；2015年播种面积和总产均创历史新高，分别达到4 496.8万hm2和26 499.2万t；此后虽有所下降，但2019年播种面积和总产量仍达4 128.4万hm2和26 077.9万t（http://www.stats.gov.cn/tjsj/ndsj/2020/indexch.htm）。因此，玉米的安全生产直接影响中国粮食安全和延伸产业的健康发展。随着全球气候变暖、栽培耕作方式转变和品种更替，玉米病虫害发生呈持续加重趋势，已成为制约玉米高产稳产的重要因素[1-3]。茎腐病是世界玉米生产中普遍发生且对生产具有重大影响的土传病害，也是中国玉米生产上具有突出影响的重要病害，是玉米全程机械化实施中的重要制约因子。近年来，茎腐病在中国玉米不同生态区持续严重发生，如2013—2015年，东北地区连续阴雨导致茎腐病高发，2014年9月上旬至中旬，黄淮地区连续降雨导致茎腐病严重发生，2016年东北、西北地区茎腐病重度发生，对玉米制种影响极大，2017年黄淮地区茎腐病偏重发生，2017—2018年东北地区重度发生（部分数据未发表），给中国玉米生产造成了重大损失，因此，控制茎腐病为害，对于保障玉米安全生产具有重要意义[3-5]。【前人研究进展】玉米茎腐病致病菌复杂多样，但中国茎腐病的病原主要为腐霉菌（以肿囊腐霉Pythium inflatum为主）和镰孢菌（以禾谷镰孢Fusarium graminearum为主）两大类[6-7]，国外多由镰孢菌引起茎腐病[8-9]。腐霉茎腐病具有突发性强的特点，其典型症状为青枯，曾在20世纪80年代对生产造成较大影响。一般发病年份，腐霉茎腐病田间发病率为 5%—10%，在病害重发年份，田间发病率可达20%—30%，一些感病品种的发病率达 40%—80%，可引起30%以上的产量损失[10-11]。与腐霉茎腐病相比，镰孢茎腐病发生更为普遍，其田间症状包括青枯和黄枯2种类型。据报道，在北美，镰孢茎腐病给玉米生产造成了严重的经济损失，堪萨斯州因镰孢茎腐病每年造成玉米减产约 5%，在重病田，发病率可达90%—100%，减产高达50%；在俄亥俄州，一般引起5%—10%的产量损失；在内布拉斯加州，一般年份因镰孢茎腐病减产5%，较重时减产10%—20%。在中国，该病引起玉米减产达20%，重度发生时造成的损失更大[4]。随着气候变化、秸秆还田和免耕少耕等栽培模式的推广，田间病原菌不断积累，致使中国玉米茎腐病发生呈加重趋势，尤其是近年来推广的高密度种植方式，使田间环境更加有利于茎腐病的发生，同时，由该病害引发或加剧的植株早衰、倒伏现象又成为推广高密度种植技术的主要障碍[12-13]。田间病害调查表明，抗病品种具有明显的降低病害发生率、减轻产量损失的作用。因此，种植和利用抗病品种是控制茎腐病的安全、经济和有效措施。优异的抗性种质是进行抗病品种选育的前提和基础。开展玉米种质资源抗茎腐病人工接种鉴定与评价，是筛选抗茎腐病种质的必要途径。王富荣等[14]结合运用田间自然发病和土壤根埋接种（土埋伤根接种）的方法，鉴定了1 550份玉米种质对腐霉茎腐病的抗性；孙淑琴等[15]采用玉米播种时埋菌接种和成株期伤茎根埋接种相结合的方法，对20个夏玉米品种进行了腐霉茎腐病抗性鉴定；宋燕春等[16]利用土壤根埋接种法鉴定了 287份重要玉米自交系对腐霉茎腐病的抗性。自2000年以来，笔者采用土壤根埋接种的方法对国家种质库保存和引进的约5 000份玉米自交系和农家种进行了抗腐霉茎腐病鉴定，筛选出一批对腐霉茎腐病抗性较好的材料，部分材料已用于抗性基因挖掘和种质创新研究[17-21]，但这些种质对镰孢茎腐病抗性如何，尚未可知。通过针扎玉米基部第一茎节注射孢子悬浮液的方式，鉴定评价了一些自交系和杂交种对镰孢茎腐病的抗性，筛选出数份抗性材料[22-24]；AFOLABI等[25]利用自然发病和带菌牙签接种相结合的方法，对50份来自国际热带农业研究所的自交系进行了多年多点抗镰孢茎腐病鉴定，获得4份高抗材料；赵子麒等[26]运用土壤根埋接种法鉴定了48份自交系对镰孢茎腐病的抗性，但其对腐霉茎腐病的抗性尚不清楚。【本研究切入点】种质资源是抗病育种的物质基础，是保障国家粮食安全和种业健康发展的战略资源，而资源的表型精准鉴定是有效利用玉米种质的重要途径和策略。国内外均十分重视玉米种质资源的抗病鉴定与评价工作，针对不同玉米病害开展了一系列抗性鉴定研究，筛选出一些抗病种质，在此基础上，开展抗病种质创制和抗病品种选育与利用，对于相关病害的控制起到了积极的作用。然而，以往大部分研究选取的材料具有一定的局限性，且抗性评价工作大多在固定的鉴定圃完成，很少涉及到多年多环境的鉴定与评价，而茎腐病的发生和为害程度受环境影响很大，玉米对茎腐病的抗性反应通常因环境不同而产生较大的差异，上述研究中筛选出的种质能否在不同环境条件和不同生态区都表现出稳定的抗性，尚未可知[5,14-17,22-24]。【拟解决的关键问题】本研究对2 004份遗传背景丰富的玉米种质资源进行大规模多年多点的田间自然发病鉴定，筛选出在大田自然条件下对茎腐病抗性较好或综合性状突出的代表性种质，用于人工接种抗性精准鉴定；建立和完善玉米种质抗腐霉茎腐病和镰孢茎腐病精准鉴定的方法，对690份代表性种质进行3年共6点的人工接种抗性鉴定，明确这些种质对腐霉茎腐病和镰孢茎腐病的真实抗性水平，筛选出不同年份和不同环境下对茎腐病均表现出稳定抗性的材料，为大规模开展玉米种质抗茎腐病精准鉴定提供有效的方法和技术规程，为玉米抗茎腐病育种和品种的抗性改良提供可利用的抗性资源，为促进玉米抗茎腐病育种，加速抗性种质的高效利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料

由国家重点研发计划“玉米种质资源精准鉴定与创新利用”项目组提供的具有丰富遗传多样性的玉米种质2 004份以及其中的690份代表性自交系。

1.2 田间自然发病试验设计与管理

田间自然发病鉴定地点均设置在玉米主产区，包括河南原阳（113°97′E，35°05′N）、山东章丘（117°30′E，36°43′N）、北京顺义（116°34'E，40°13'N）、北京房山（116°04′E，39°38′N）、辽宁沈阳（123°58′E，42°04′N）、吉林公主岭（124°48'E，43°30'N）、黑龙江哈尔滨（126°63′E，45°75′N）等地。选择具有代表性，中上等肥力水平试验地。试验田平整、平坦，施肥水平及其他管理与当地生产水平相当。试验采取随机排列，3 m行长，单行种植，2—3次重复，密度为60 000—67 500 株/hm2。

1.3 田间茎腐病自然发病调查与评价

在玉米生长后至蜡熟后期，参照玉米抗病虫性鉴定技术规范（NY/T 1248.6-2016和NY/T 1248.7-2016）[27-28]，采用目测典型症状如植株明显枯黄/枯死/果穗倒挂等，结合手捏法进行田间茎腐病调查，茎基部变软、空松，能用手捏动植株判定为发病株。根据调查发病株数、总株数，计算发病率，进行抗性评价。

1.4 茎腐病人工接种精准鉴定

1.4.1 鉴定用病原菌 具有致病力强的肿囊腐霉（P.inflatum）和禾谷镰孢（F.graminearum），分别由中国农业科学院作物科学研究所和辽宁省农业科学院植物保护研究所采集、分离、纯化、培养并保存。

1.4.2 试验设计 抗茎腐病精准鉴定在具有喷灌设施或者灌溉条件良好的抗病鉴定圃进行。同一批次的种质材料在3个不同生态环境中进行2年抗性鉴定，或在2个不同生态环境中进行3年的抗性鉴定。腐霉茎腐病鉴定圃设置在北京昌平（116°14′E，40°10′N）、河南原阳（113°97′E，35°05′N）、河南长葛（113°52′E，34°10′N），镰孢茎腐病鉴定点设置于辽宁沈阳（123°58′E，42°04′N）、吉林公主岭（124°48'E，43°30'N）、吉林梨树（124°33′E，43°32′N）。

试验材料采取随机排列，每份材料双行种植，行长5.0 m，行距0.6 m，每行留苗25株，植株密度为67 500株/hm2。田间采用双小区（背靠背）种植（根据当地的播种习惯，背靠背中间可种植高粱或留 40 cm的小过道），观察道宽1 m。每隔100行设置1组已知抗病/感病对照材料，常用的为自交系齐319（抗）或1145（抗）、掖107（感）（如果某鉴定点出现上述抗、感自交系生长不适的话，在现有对照种的基础上，再增加一组适于当地生长且抗感特性稳定的材料作为对照种）。

1.4.3 接种 将致病力强的肿囊腐霉或禾谷镰孢接种于直径为9 mm、含有20 mL经高压灭菌的PDA（马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂20 g和水1 000 mL）平板培养基上，于25℃黑暗培养5—7 d，待菌丝布满PDA表面时，按每10皿菌体兑水700 mL的比例，匀浆成糊状，用于注射接种。

在玉米植株散粉后3—5 d，在植株靠近地表的第2茎节中部，利用电钻（配以直径6 mm钻头）以45°角向斜下方打孔，深度达茎髓中部。钻孔后，以灌有糊状接种体的无针头注射器将 1.0 mL病菌接种体注入玉米植株茎髓中，并以凡士林密封孔口。接种后田间充分浇灌1次，然后进行正常肥水管理。发病过程中，选择连续的晴天进行浇灌1—2次水，模拟暴雨暴晴的病害诱发条件。

1.4.4 抗病性调查与评价 在接种后的鉴定材料生长进入蜡熟期（接种后40 d），即可进行调查。调查时，先砍除茎秆上部节段，留地上茎4—5节，纵剖茎秆，从纵剖面查看茎秆中茎髓部变色或坏死的病斑区域大小。逐株调查茎髓部发病面积，记载发病级别（表1）。

表1 玉米对茎腐病抗性的发病级别划分Table 1 Classification of disease score of maize resistance to stalk rot

根据单株病情级别，计算每份鉴定材料的平均病情级别，进行抗性评价（表2）。

表2 玉米对茎腐病抗性的评价标准Table 2 The criteria of evaluation of maize resistance to stalk rot

茎腐病平均病情级别计算公式如下：

SRS为茎腐病病情级别（stalk rot score，SRS），SRSA为茎腐病平均病情级别（stalk rot score on average，SRSA）；i=1为第1个单株，n为最后第n个单株。计算保留1位小数。

1.5 数据分析

利用Excel 2010对抗性鉴定的表型数据进行分析与处理，利用R语言对鉴定结果进行相关性分析。

2 结果

2.1 玉米种质对茎腐病的自然发病鉴定与评价

2016—2018年，各自然发病鉴定圃的茎腐病发生状况表明，在田间自然发病条件下，茎腐病发病程度受环境影响大，不同年份间和不同环境条件下，发病程度差异明显。2016年，各自然发病鉴定圃的茎腐病均发生较轻；2017年，辽宁沈阳、北京顺义和山西定襄的茎腐病偏重发生，感病和高感材料的占比达45%；2018年，山西定襄地区的茎腐发生较重，其他鉴定点均发生偏轻。通过对2016—2018年各自然发病鉴定点的抗性鉴定数据进行综合分析，发现共有508份种质在田间自然发病条件下，在各鉴定点均对茎腐病表现出较为稳定的抗性，其中表现高抗（highly resistant，HR）、抗病（resistant，R）和中抗（moderately resistant，MR）的材料分别为79、106和 323份，上述自交系将成为玉米抗茎腐病人工接种精准鉴定种质选择的重要参考（表3）。

表3 2016—2018年田间自然发病鉴定中对茎腐病表现不同抗性的部分种质Table 3 Some maize germplasm with different levels of resistance to stalk rot from naturally infected identification during 2016-2018

2.2 玉米种质抗茎腐病精准鉴定方法比较分析

2016—2017年，在北京昌平和河南原阳，利用土壤根埋接种和茎基部注射接种法对随机挑选的 90份玉米品种和种质资源进行了腐霉茎腐病和镰孢茎腐病的抗性鉴定（图1），结果表明，用上述2种方法鉴定评价的结果绝大部分一致，在腐霉茎腐病鉴定中，抗病对照齐319的发病率和抗性级别分别为16.7%和4.5，均表现为中抗，感病对照掖107的发病率和抗性级别分别为33.3%和8.5，表现为感病（susceptible，S）和高感（highly susceptible，HS），其中，86.7%的被鉴定材料在2种鉴定方法中，对腐霉茎腐病的抗性反应表现一致（相同的抗性水平），仅极少数材料在 2种鉴定方法中表现出较大差异。利用上述2种方法进行的腐霉茎腐病鉴定评价结果的相关性分析显示，两者的相关系数r=0.87，表明2种接种方法的评价结果具有高度的相关性（图 2-A）。在镰孢茎腐病抗性鉴定中，抗病对照齐319在上述2种鉴定方法中分别表现为抗病和中抗，感病对照掖 107均表现为高感，81.1%的被鉴定材料对镰孢茎腐病的抗性反应表现一致，2种鉴定方法的评价结果之间的相关系数r=0.84，表明两者之间的相关性高（图 2-B）。整体来看，与土壤根埋接种相比，注射接种时直接把接病原物定量注入茎髓部，确保每株玉米能成功接种，因此，被鉴定材料整体上发病程度更充分，可有效用于玉米抗茎腐病种质资源的筛选，为规模化开展玉米种质抗茎腐病精准鉴定奠定了基础。

图1 2种不同方法接种玉米茎腐病Fig.1 Inoculation of maize stalk rot

图2 利用土壤根埋接种和茎基部注射接种法鉴定玉米对茎腐病抗性的相关性分析Fig.2 Correlation analysis between soil inoculation and drilling inoculation for screening of maize resistance to stalk rot

2.3 玉米种质对腐霉茎腐病的抗性精准鉴定与相关性分析

2018—2020年，在北京昌平、河南长葛和河南原阳，利用茎基部注射法对690份代表性玉米种质进行了人工接种鉴定，病害调查显示，3个鉴定点的材料均充分发病，其中，昌平点的发病程度更严重。抗病对照齐 319和感病对照掖 107的发病级别分别为3.3—5.4和7.3—9.0，表现为抗病-中抗和感病-高感。综合分析每年的抗病鉴定数据表明，2018年，在2个鉴定点（北京昌平、河南长葛）对腐霉茎腐病综合表现高抗（HR）、抗病（R）、中抗（MR）、感病（S）和高感（HS）的种质占比分别为0、0、3.2%、14.3%和82.6%；2019年，在2个点（北京昌平和河南原阳）综合表现为HR、R、MR、S和HS的种质占比分别为0、0、4.2%、15.4%和80.3%；2020年，在北京昌平和河南原阳均表现HR、R、MR、S和HS的种质占比分别为0、1.2%、4.8%、21.8%和72.2%，3年的抗性鉴定结果具有较好的一致性。通过对3年共6点的腐霉茎腐病鉴定结果进行相关性分析发现，不同年度和不同鉴定点之间的相关系数（r）为0.46—0.72，其中同一年度（2018、2019和2020年）2个鉴定点之间的r值分别为0.66、0.60和0.65，同一鉴定点不同年度间（北京昌平2018与2019年、2019与2020年、2018与2020年）相关系数分别为0.72、0.55和0.46，河南长葛（或原阳）不同年度间相关系数分别为0.68、0.67和0.72，表明各点之间的鉴定结果存在较好的相关性。3个年度间种质的综合抗性相关性分析显示，2018与2019年、2019与2020年、2018与2020年的r值分别为0.67、0.84和0.87，表明年度间综合抗性的结果一致性高（图3—图5）。

图3 玉米种质接种腐霉茎腐病的田间症状Fig.3 The symptom of maize Pythium stalk rot in the field

图4 不同玉米种质接种腐霉茎腐病的茎髓部症状Fig.4 The symptom of maize stalk pith tissues caused by Pythium stalk rot

图5 2018—2020年玉米种质在不同环境下对腐霉茎腐病抗性鉴定的相关性分析Fig.5 Correlation analysis between maize resistance to PSR at different environments during 2018-2020

综合分析3年共6点的鉴定数据，筛选出24份对腐霉茎腐病抗性较好的种质，其中，冀资 H676、辽2235、冀资14L88、冀资14L101、丹337、M02N-23、Y1747、HRB16232、T628358、161085在各年各点的抗性均表现稳定，是不可多得的抗腐霉茎腐病资源（表4）。

表4 2018—2020年抗腐霉茎腐病精准鉴定中表现稳定抗性的24份种质Table 4 Twenty-four maize germplasm with stable resistance to Pythium stalk rot from precise characterization during 2018-2020

2.4 玉米种质对镰孢茎腐病的抗性精准鉴定与相关性分析

2018—2020年，在辽宁沈阳、吉林公主岭、吉林梨树3个鉴定点共6个环境下，利用茎基部注射法对690份代表性玉米种质进行了镰孢茎腐病接种鉴定，在蜡熟期进行的病害调查显示，抗病对照齐319和感病对照掖107的发病级别分别为2.5—5.5和7.5—9.0，表现为抗病-中抗和感病-高感，表明抗病鉴定结果有效。辽宁沈阳鉴定点的接种材料3年发病程度均非常充分，被鉴定种质在3年间的抗性表现较为一致，绝大部分材料均表现为感病或高感；而2018年吉林梨树接种的茎腐病发生明显偏轻，2019—2020年吉林公主岭的发病也欠充分，数据分析表明，2018—2020年，吉林3个环境下的镰孢茎腐病发病程度在年度间存在较大差异，且同一年份中，吉林梨树或公主岭与辽宁沈阳鉴定点的发病程度差异大，可能与接种操作、环境条件差异以及接种后的田间管理方式相关，但玉米种质在每年2个点的综合抗性表现较为一致。通过对3年各点的镰孢茎腐病鉴定结果进行相关性分析显示，6个环境之间的相关系数为0.00—0.76，同一年度（2018、2019和2020年）2个鉴定点之间的r值分别为0.12、0.04和0.05，辽宁沈阳不同年度间（2018与2019年、2019与2020年、2018与2020年）抗性的相关系数分别为0.50、0.65和0.53，吉林梨树（或公主岭）不同年度间相关系数分别为0.07、0.76和0.00，表明辽宁沈阳鉴定点3年间的结果以及2019与2020年吉林公主岭的结果具有较强的相关性，其他各点的相关性弱，鉴定结果差异大。3个年度间镰孢茎腐病的综合抗性相关性分析显示，2018与2019年、2019与2020年、2018与2020年的r值分别为0.40、0.74和0.72，表明年度间的综合抗性结果相关性较高（图6—图7）。综合6个环境下的鉴定数据发现，5份种质（冀资 C32、辽 785、辽 2235、吉资 1034和 16SD088）在各年各点均对镰孢茎腐病表现出稳定的抗性，是不可多得的抗镰孢茎腐病资源（表5）。

图6 不同玉米种质接种禾谷镰孢茎腐病的茎髓部症状Fig.6 The symptom of maize stem pith tissues caused by Gibberella stalk rot

图7 2018—2020年玉米种质在不同环境下对镰孢茎腐病抗性鉴定的相关性分析Fig.7 Correlation analysis between maize resistance to GSR at different environments during 2018-2020

表5 2018—2020年抗镰孢茎腐病精准鉴定中表现稳定抗性的玉米种质Table 4 Five maize germplasm with stable resistance to Gibberella stalk rot from precision identification during 2018-2020

2.5 玉米种质对2种茎腐病抗性的相关性分析

对 690份玉米种质的腐霉茎腐病和镰孢茎腐病的综合抗性进行相关性分析（图8），发现这些种质对 2种茎腐病抗性的相关系数为 0.44，表明上述材料对腐霉茎腐病和镰孢茎腐病的抗性存在中等水平的相关性，由此推测部分种质对这两种茎腐病具有相似的抗病机制，但大部分种质对这两种病害的抗性存在差异。在上述 690份资源中，辽 2235和16SD088对腐霉茎腐病和镰孢茎腐病均表现出较好的抗性，将为玉米抗茎腐病育种和品种抗性改良提供重要的抗源材料。

图8 玉米种质对腐霉茎腐病与镰孢茎腐病抗性的相关性分析Fig.8 Correlation analysis between PSR and GSR resistance in 690 maize germplasm

3 讨论

玉米是中国主要的粮食作物和饲料作物，保障玉米安全生产，降低生产成本，不断提高产量和品质，对于促进玉米产业健康发展和保障中国粮食安全具有重要意义。腐霉茎腐病和镰孢茎腐病是玉米生长中后期的重要病害，生产上尚无针对该病害的有效防控手段，利用抗性品种无疑是控制茎腐病最为理想的措施。鉴于玉米茎腐病对生产为害的严重性以及品种抗性的重要性，在国家玉米新品种审定标准中，在中国所有玉米生态区，对高感茎腐病的品种实行一票否决，即玉米新品种的茎腐病田间自然发病和人工接种鉴定均未达到高感，否则不予以审定，因此，抗病性已成为玉米新品种不可或缺的特性。近年来，玉米种质和品种的抗病性鉴定与抗病品种的推广得到了社会的广泛认可，玉米育种工作者、育种企业和种植户对于品种抗病的重要性认识不断提高。玉米种质资源是抗病育种的物质基础，精准鉴定和筛选出具有不同遗传背景且在不同环境条件下均对茎腐病表现稳定抗性的种质，对于促进玉米抗病育种具有重要意义。

3.1 玉米种质对茎腐病的自然发病鉴定与评价

本研究首次通过大规模多年多点的田间自然发病鉴定与多年多点的人工接种鉴定相结合的方式，精准鉴定和评价了玉米种质对腐霉茎腐病和镰孢茎腐病的抗性水平。在2016—2018年，对2 004份具有广泛遗传背景的玉米种质进行了多环境（黄淮、京津冀、东北和西北）的田间自然发病鉴定，初步筛选出在田间自然发病条件下对茎腐病抗性较好的种质508份以及对其他病害综合抗性好的种质，结合农艺性状的田间综合表现，挑选出部分对茎腐病或其他常见病害抗性较好或综合性状比较优异的代表性种质690份，进行了3年共6个环境的人工接种精准鉴定，最终筛选出对腐霉茎腐病和镰孢茎腐病具有稳定抗性的玉米种质各24和5份。

综合分析玉米田间自然发病与人工接种抗性鉴定的数据表明，与人工接种鉴定相比，田间自然发病鉴定确实存在许多不确定性，如不能保证同一批次的材料都感染病原菌、在不同环境可能存在不同种病原、病原菌侵染与玉米敏感生育期能否吻合、发病条件不进行任何人工干预、田间环境条件完全不可控等，导致表型受环境影响更大，对茎腐病而言尤为如此；人工接种则能保证被鉴定材料均能接种上特定病原菌，并且在接种后于鉴定圃创造适宜茎腐病病原菌侵染和扩展的环境条件，诱导该病害的发生和发展。本研究表明，在自然发病中对茎腐病表现较好抗性的材料，在人工接种后，大多表现出感病症状，而通过人工接种鉴定出的抗性种质，在自然发病中均对相应病害表现抗病，这种情况不难理解，因为接种物的单位体积病原菌浓度通常大大高于土壤中该病菌的自然浓度，且接种后鉴定圃中的环境条件适于茎腐病发生，无疑会导致茎腐病发生加重。尽管如此，由于自然发病是在多年多环境下进行的，其发病条件与大田生产品种所处的环境完全一致，在某种意义上讲，自然发病鉴定的结果更接近于田间真实的抗性水平，因此，自然发病鉴定的结果具有一定的参考价值[29]。

3.2 玉米种质抗茎腐病精准鉴定方法比较分析

本研究建立和完善了玉米种质抗茎腐病精准鉴定的新方法-茎基部注射法，利用该方法，对690份玉米代表性种质进行了抗腐霉茎腐病和镰孢茎腐病精准鉴定，明确了上述种质对腐霉和镰孢茎腐病的真实抗性水平，筛选出20余份对茎腐病具有稳定抗性的材料。关于玉米茎腐病接种鉴定的方法，腐霉茎腐病以往通常采用土壤根埋接种（土埋伤根接种）法进行鉴定[5,14,16-18]，也有通过播种时埋菌接种结合成株期伤茎根埋接种鉴定[15]和苗期接种鉴定的报道[30]。而镰孢茎腐病的鉴定，则通过土壤根埋接种法[26,31-33]、针扎玉米基部第一茎节注射孢子悬浮液[22,24]或带菌牙签接种[25]等方法进行，其中土壤根埋接种法应用广泛。与茎基部注射法相比，土壤根埋菌法操作较为简单，接近田间植株发病的实际情况，比较直观，缺点是接种物用量大，接种和调查评价的操作相对较为粗放，接种时很难做到定量，且不能保证被鉴定的每株玉米都能接种上病原菌，调查时采用手捏茎基部是否变软来确定发病株，导致不同调查人之间容易出现一定误差；后者直接将定量的接种物注入玉米基部茎秆中，能确保被鉴定的每株材料均能定量接上病原菌，发病更为充分，而调查时剖开每株材料茎秆，根据病斑区域大小确定发病面积和病情等级，提高抗性评价精度，可有效用于种质资源的抗性鉴定评价，结果更为可靠，但鉴定过程涉及茎基部钻孔、注射和凡士林封口以及逐株剖秆调查等试验程序，工作量大且耗时费力。总之，上述2种茎腐病的接种鉴定方法，各有其优缺点，玉米根际土壤埋菌法适用于玉米新品种的抗茎腐病鉴定与评价，茎基部注射接种法则更适合于种质资源抗茎腐病的精准鉴定。

3.3 玉米种质对腐霉茎腐病和镰孢茎腐病的抗性精准鉴定与相关性分析

通过对腐霉茎腐病3年共6个环境的抗性鉴定数据进行的相关性分析表明，6个环境条件下的腐霉茎腐病抗性鉴定结果之间均存在较强的相关性，每年2个鉴定点之间的鉴定评价结果一致性较高，年度间的抗性评价结果也具有较高的一致性，尤其是不同年度间2个环境的综合抗性情况更是趋于一致。然而，本研究中的690份代表性种质对镰孢茎腐病的反应，在同一年份的2个鉴定点之间表现出很大的差异，吉林梨树和公主岭的玉米种质发病程度远远低于同年辽宁沈阳的同批次材料，在吉林梨树和公主岭鉴定点表现抗病或中抗的一些种质，在辽宁沈阳均表现出感病或高感，相关性分析也显示出同一年度2个鉴定点评价结果的相关性非常低，且3年均是如此，可能与2个鉴定点的不同人员接种操作、环境条件差异以及接种后的田间管理方式和精细程度密切相关，然而，不同年度间2个环境的镰孢茎腐病综合抗性均具有较高的一致性，表明多年多点鉴定对于筛选抗茎腐病的种质具有重要意义，只有在不同环境条件、不同病害选择压力下均表现出抗病的材料，才是真正具有稳定抗性种质的资源。

4 结论

对 2 004份遗传背景丰富的玉米种质资源进行了 3年多环境的茎腐病田间自然发病抗性鉴定，筛选出 508份种质在各鉴定点均对自然发病条件下的茎腐病表现出较为稳定抗性。建立和完善了玉米抗腐霉茎腐病和镰孢茎腐病精准鉴定的新方法-茎基部注射法，并利用该方法对 690份代表性玉米种质进行了3年共6个环境的腐霉茎腐病和镰孢茎腐病抗性精准鉴定，发现这些种质对 2种茎腐病的抗性具有中等水平的正相关性，筛选出对腐霉茎腐病和镰孢茎腐病具有稳定抗性的玉米种质各24和5份，其中2份材料对2种茎腐病同时表现出稳定的抗性，是开展玉米抗茎腐病育种或对主栽品种进行抗性改良的重要抗源。

致谢：中国农业科学院作物科学研究所李春辉副研究员提供了玉米材料的种子和杂种优势类群数据，在此表示感谢。