宁麦系列小麦品种的性状特点及相关基因位点分析

2022-02-24姜朋张鹏姚金保吴磊何漪李畅马鸿翔张旭

中国农业科学 2022年2期

姜朋，张鹏，姚金保，吴磊，何漪，李畅，马鸿翔，张旭✉

1江苏省农业科学院/现代作物生产省部共建协同创新中心/CIMMYT-JAAS小麦病害联合研究中心，南京210014；2扬州大学农学院/江苏省粮食作物现代产业技术协同创新中心/江苏省作物基因组学与分子育种重点实验室/植物功能基因组学教育部重点实验室，江苏扬州 225009

0 引言

【研究意义】长江中下游麦区是中国第二大麦区[1]，江苏省农业科学院育成的宁麦系列品种在本区域小麦生产中占有重要地位，宁麦3号、宁麦6号、宁麦8号、宁麦9号、宁麦13、宁麦14等均是当地不同年代的主推品种，目前，尤其是宁麦13已连续5年成为江苏省推广面积最大的小麦品种（数据由江苏省农技推广总站提供）；宁麦8号、宁麦9号、宁麦13等是常用的小麦育种亲本，其中，宁麦9号的衍生品种已超过20个[2-3]；宁麦8号、宁麦9号和宁麦13还是遗传、生理等理论研究的重点材料[4-6]。对宁麦系列品种的性状特点、系谱组成、遗传多样性及其重要性状的控制位点等开展系统分析，可为育种利用提供理论指导，同时也有助于针对性地进行品种改良。【前人研究进展】张晓等[7]与王君婵等[8]对扬麦系列品种的品质性状、重要性状功能基因等进行了系统分析，为扬麦系列品种在生产及育种中的应用提供了理论依据。殷贵鸿等[9]总结了周口市农业科学院小麦育种团队2010年以来的科研成果及育种经验，并提出下一步的育种目标与措施，对周麦系列品种的发展具有重要意义。关于宁麦系列品种的研究已有诸多报道[10-11]，特别是对优良亲本宁麦9号的研究较为深入，研究者初步明确了其产量、品质、抗病性等性状的遗传特点[3,12-14]，并评价了其对后代的遗传贡献[2,15]。分子标记技术的发展为作物的遗传研究提供了重要工具，特别是近年来广泛应用的SNP标记，具有遗传稳定、数量多、分布广等特点，基于其开发的 9K、90K、660K等基因芯片广泛应用于关联分析、连锁作图及遗传多样性评价等研究[16-20]。中国农业科学院作物科学研究所与Affymetrix公司合作开发的Affymetrix 50K基因芯片（北京博奥晶典生物技术有限公司）集成了一些重要性状的功能标记位点，可直接用于种质资源及育种材料的检测评价。【本研究切入点】宁麦系列品种经过30年的发展，逐步形成了赤霉病抗性突出、弱筋品质优良的品种特色，在生产与研究中具有重要地位。虽然已对个别品种开展了较为深入的研究，但对大部分宁麦系列品种重要性状的遗传组成尚不明确。【拟解决的关键问题】本研究以宁麦系列23个已审定品种及51份高代品系为材料，利用中国农业科学院作物科学研究所与Affymetrix公司合作开发的50K基因芯片获取基因型，同时结合功能基因鉴定，一方面对宁麦系列品种（系）的遗传多样性进行评价；另一方面系统分析宁麦系列品种（系）的重要性状功能基因的组成，为宁麦系列品种的遗传改良及育种利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

23个已审定的宁麦系列品种和51份高代品系（图1和电子附表1），均由江苏省农业科学院麦类作物研究室保存。

图1 宁麦系列品种的系谱Fig.1 Pedigrees of Ningmai series wheat cultivars

对宁麦系列品种的主要性状表现进行系统整理，数据主要来源于各品种的审定报告，产量性状数据来源于生产试验数据，同时通过省审定和国家审定的品种则采用省审定数据，品质数据采用2年区试结果平均值（表1）。中国品种审定制度于20世纪90年代确立[21]，因此，早期品种宁麦3号与宁麦6号缺乏相关数据。

表1 宁麦系列品种的主要性状表现Table 1 The performance of main traits in Ningmai series wheat cultivars

1.2 基因型分析

将74份试验材料种子室温萌发7 d左右，剪取幼嫩叶片，采用 CTAB法提取基因组 DNA[22]。利用中国农业科学院作物科学研究所与Affymetrix公司合作开发的小麦 50K SNP芯片对所有材料进行全基因组扫描，芯片包含部分重要性状的功能基因[23]，基因芯片测试服务由北京博奥晶典生物技术有限公司提供。此外，对芯片不包含的重要性状功能基因进行了补充分子标记鉴定（表2与电子附表2）。

表2 宁麦系列品种（系）重要性状相关位点的分布Table 2 Distribution of the loci relatedto important traits in Ningmai series varieties (lines)

续表2 Continued table 2

根据RASHEED等[23]报道的KASP标记序列合成引物，每个标记设计2条SNP特异性引物（F1/F2）和1条通用引物（R），F1尾部添加能够与FAM荧光结合的特异性序列（5′-GAAGGTGACCAAGTTC ATGCT-3′），F2尾部添加能够与HEX荧光结合的特异性序列（5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′）。根据吴磊等[24]和 BIE等[25]研究合成抗赤霉病基因Fhb1的诊断标记 JAASM395与抗白粉病基因 Pm21的诊断标记MBH1设计引物。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

KASP反应总体系为5 μL，包含2×KASP Master Mix 2.5 μL、KASP Assay Mix（引物混合工作液）0.07 μL、浓度为 20 ng·μL-1的模板 DNA 2.43 μL。KASP 反应程序为 94℃ 15 min；94℃ 20 s，61—55℃1 min，每个循环降低0.6℃，共10个循环；94℃ 20 s，55℃ 1 min，共26个循环。通过KASP荧光分析仪（LGC公司型号为PHERAstar plus）扫描分析PCR结果。

电泳检测标记的 PCR扩增体系为 10×buffer 1µL、25 mmol·L-1的MgCl20.5 µL、2.5 mmol·L-1的dNTP 0.5 µL、10 µmol·L-1的前后引物各 0.1 µL、5 U·µL-1的Taq 聚合酶 0.2 µL、50 ng·µL-1的 DNA 模板 3 µL，ddH2O 补至 10 µL。PCR 扩增程序为 94℃ 3 min；94°C 15 s，58°C 30 s，72°C 30 s，35 个循环；72°C 5 min。扩增产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.3 数据分析

利用Microsoft Excel 2016对基因芯片数据进行初步处理，过滤掉缺失率＞10%，最小基因频率＜5%的标记。参照 BOTSTEIN等[26]的方法计算多态性信息量（polymorphism information content，PIC），利用NTSYSpc version 2.10t软件计算遗传相似性系数，在Mega 6.0软件中作Neighbor Joining聚类分析[27]。

2 结果

2.1 宁麦系列品种的主要性状表现

宁麦系列品种的丰产性较为突出，在统计的 21个品种中，较对照增产超过5%的有14个，更有4个品种增产超过9%（表1）；从产量三要素来看，不同品种的穗数、穗粒数及千粒重差异较大，千粒重随着审定时间的推移呈上升趋势，而穗数与穗粒数的变化趋势不明显。不同品种的株高也存在较大差异，宁麦24、宁麦26的株高约80.0 cm，而宁麦15、宁麦23等则达到95.0 cm，其余品种均在此范围内。从籽粒蛋白含量与稳定时间来看，达到弱筋小麦标准的品种有5个，分别为宁麦8号、宁麦9号、宁麦13、宁麦18和宁麦 27，而达到强筋小麦标准的品种仅有宁麦 12与宁麦26。在抗病性方面，宁麦系列品种的赤霉病与黄花叶病抗性突出，赤霉病多数表现为中抗，宁麦20更是达到抗，宁麦9号、宁麦13、宁麦16等表现为抗黄花叶病；白粉病与纹枯病抗性一般，多数为中感，少数品种达到中抗水平；锈病抗性较差，叶锈病、条锈病及秆锈病均表现感病。

2.2 宁麦系列品种的遗传分析

2.2.1 标记的多态性分析及其分布经过多态性及缺失标记筛选，共获得28 253个高质量SNP位点用于进一步遗传分析，A、B、D染色体组分别包含8 973、10 532和8 748个标记，其中，3B染色体上标记最多，达到2 430个，4D染色体标记最少，为729个（图2）。各位点多态性信息含量（PIC）值为0.10—0.67，差异较大，平均为0.36。

图2 各染色体的标记分布及其多态性信息含量Fig.2 SNP distribution and the polymorphism information content on the chromosomes

2.2.2 宁麦系列品种的遗传相似性及聚类分析已审定的23个品种间的遗传相似系数为0.407—0.964，平均为 0.600；51个高代品系间的遗传相似系数为0.456—0.985，平均为0.684，呈现更高的遗传相似性（图3和电子附表3）。从高代品系与已育成的品种的遗传相似系数看，各品系与宁麦13、宁麦14、宁麦24、宁麦26、宁麦27、宁麦28等品种的遗传相似性较高，平均在0.650以上，而与宁麦11、宁麦15、宁麦16、宁麦17、宁麦23的遗传相似性较低，平均在0.500以下。

品种系谱显示，宁麦8号、宁麦9号与扬麦158等3个品种扮演了核心亲本的角色，而宁麦8号的亲本扬麦5号是扬麦158的姊妹系，结合聚类分析结果，可将育成品种分为2个类群（图4-A），宁麦12、宁麦15、宁麦17、宁麦22、宁麦23等可与宁麦8号归为一类，它们有的是从宁麦8号系统选择而来，有的与宁麦8号拥有相同的亲本；宁麦13、宁麦14、宁麦16、宁麦18、宁麦24、宁麦26等可与宁麦9号归为一类，它们有的是从宁麦9号系统选择而来，有的是宁麦9号与其他亲本杂交育成，与宁麦8号的类群相比，其品种间遗传距离较近。结合遗传相似性及聚类分析发现新选育的高代品系与宁麦9号相似性更高，亲缘关系更近（图3和图4-B）。

图3 宁麦系列品种（系）的遗传相似系数Fig.3 Genetic similarity coefficients among the Ningmai varieties (lines)

2.3 宁麦系列品种（系）重要性状相关位点的分布

2.3.1 农艺性状相关标记检测春化基因Vrn-A1在所有材料中均表现为Vrn-A1b冬性变异类型，通过对其另外 2个功能变异位点的检测结果显示，83.3%的材料需较长的春化时间，81.1%的材料表现为晚花类型；Vrn-B1均表现为冬性变异类型；93.2%的材料为Vrn-D1a春性变异类型。控制光周期反应的主要基因Ppd-D1在所有材料中均为光周期迟钝类型，而其同源位点Ppd-A1与Ppd-B1则均为光周期敏感类型。株高位点的检测结果显示所有材料均为 Rht-B1b/Rht-D1a变异类型。

2.3.2 产量相关标记检测千粒重调控位点 TaGS2-A1、TaGS5、TaGS-D1、TaGASR、TaSus1、TaSus2、TaCKX6-D1及TaGW7等在多数材料中（76.4%—100.0%）均表现为增加千粒重的等位变异，TaCwi-A1与TaTGW6在所有材料中表现为降低千粒重的等位变异，仅有 4份材料携带穗粒数控制位点 TaMOC1-7A的优势等位变异。

2.3.3 抗穗发芽相关标记检测宁麦系列小麦品种多为红皮小麦，抗穗发芽，分子标记检测结果显示抗穗发芽基因 TaSdr-A1在所有材料中均表现为TaSdr-A1a不抗穗发芽类型，而其同源基因TaSdr-B1则均为TaSdr-B1a抗穗发芽类型；TaVp-1B均呈现不抗穗发芽的Vp1Ba变异类型；TaPHS1具有多个变异位点，-222变异位点处均为不抗穗发芽的等位变异，+646和+666处功能变异位点在检测材料中呈现 GT和AA 2种单倍型，其中40.5%的材料为抗穗发芽的单倍型（AA）。

2.3.4 品质性状相关标记检测宁麦系列品种的硬度控制位点Pina-D1均为Pina-D1a软麦类型，Pinb-D1位点在不同材料存在差异，35.1%的材料为 Pina-D1b变异类型。蛋白质含量控制位点 Gpc-B1均表现为正常水平蛋白质含量的等位变异类型。高分子量谷蛋白亚基Glu-A1位点处有71.6%的材料为1类型；Glu-B1位点处均不携带Bx13亚基；在Glu-D1位点处，47.3%的材料携带5+10亚基，52.7%的材料为2+12或其他亚基类型。与黄色素含量（yellow pigment content，YPC）相关的基因中，番茄红素合成酶基因的3个同源位点 Psy-A1、Psy-B1与 Psy-D1分别为 Psy-A1b、non-Psy-B1c与Psy-D1a类型，均为降低黄色素含量的等位变异；43.2%的材料在番茄红素脱氢酶 TaPds-B1位点处呈现TaPds-B1a增加黄色素含量的等位变异。在多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）活性控制位点上，87.7%的材料为低活性的 PPO-A1b类型，51.4%的材料为低活性的 PPO-D1a类型。脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）活性控制位点 Lox-B1均为低活性的Lox-B1b类型。

2.3.5 抗病性相关标记检测秆锈病、叶锈病及褐斑病均不是长江中下游麦区的常发病害，抗秆锈病基因（Sr2、Sr36）、抗叶锈病基因（Lr34和 Lr67）及抗褐斑病基因（Tsn1）在所有材料中均未发现。抗赤霉病主效基因 Fhb1在检测材料中的分布频率达到48.6%，是宁麦系列小麦品种赤霉病抗性的重要来源。宁麦系列品种在白粉病抗性方面表现一般，已审定品种均不携带抗白粉病基因 Pm21，而在高代品系中这一情况有所改善，分布频率达到近30%。

3 讨论

3.1 宁麦系列品种的性状特点与遗传多样性

宁麦系列品种立足长江中下游麦区的气候条件及生产特点，培育了宁麦9号、宁麦13、宁麦18等优质弱筋品种，宁麦14、宁麦16、宁麦24等中筋品种，以及中强筋品种宁麦 26，突出的赤霉病抗性与良好的丰产性是宁麦系列品种的重要特色，为保障粮食安全、农业增效及农民增收作出了重要贡献。近年来，小麦市场受国际市场和国内需求变化的影响，弱筋粉较多地以进口淀粉加中强筋面粉混合替代，使得淮南麦区的中强筋、强筋小麦新品种越来越受到市场的青睐[28-29]，受极端气候影响，小麦白粉病、锈病等的发病范围与发病程度呈上升趋势[30]，严重威胁小麦生产，给小麦育种带来了新的挑战。

中国现代品种的遗传多样性随着育种历程呈现逐渐下降的趋势[31]，宁麦系列品种亦呈现这一特点，已审定品种的遗传相似系数平均为0.60，而新选育的高代品系的遗传相似系数平均达到0.68。育种过程中包含强烈的人工选择，一些承受强选择作用的基因在群体中的多样性显著降低，同时，这些基因附近区域由于牵连效应遗传多样性也明显下降[32]。从系谱来看，2000年之后育成的品种多含有宁麦8号和宁麦9号的遗传背景，并且这两个品种也是本区域近年来小麦生产中广泛采用的亲本。其中，宁麦8号具有高产、半矮秆抗倒、大穗、多粒的优点，宁麦9号则多穗、多粒、品质优良且抗病性突出。两个品种优良性状具有一定的互补性，利用二者配组选育出宁麦16、生选6号、扬辐麦4号等品种。随着宁麦9号的系选品种宁麦13在生产上取得巨大成功，宁麦9号的衍生品种更是逐渐增多，如宁麦 14、宁麦 24、宁麦 26、生选6号、扬麦18、扬麦21、南农0686、镇麦8号、苏麦8号、农麦126等。宁麦9号与3个系选品种宁麦13、宁麦14及宁麦24的遗传相似系数在0.7左右，而这3个品种间的遗传相似系数均超过 0.9，推断在宁麦 9号剩余变异群体中的选择过程中可能出现一次较大的基因重组或突变事件，保留了宁麦9号的诸多优良性状，如矮秆、多穗、多粒等，同时抗倒性、千粒重等性状得到改善，使品种的丰产性、稳产性大大提高。

株高是育种选择的重要指标，宁麦9号类群品种的株高显著低于宁麦8号类群，可能使宁麦9号类群的后代大量保留，进而使品种同质化程度升高。由此可见，宁麦系列品种急需拓宽遗传基础，实现品种升级。通过远缘杂交[33]或尽可能避免遗传背景过近品种（系）间杂交[34]，有助于丰富品种的遗传多样性，培育出突破性的新品种。

3.2 宁麦系列品种（系）重要性状相关位点的分布

宁麦系列品种（系）几乎都为春性品种， Vrn-D1位点的变异可能是多数材料表现春性的主要原因；多数材料为光周期迟钝型，主要由光周期反应基因Ppd-D1决定；当前在育种中主要利用了Rht-B1位点的变异来降低株高，未来可尝试引入Rht-D1位点的变异。

产量要素中，千粒重的遗传力最高，其相关遗传位点报道最多，一些重要的千粒重调控位点的优势等位变异已经在现有材料中固定下来，如 TaGS2-A1、TaGS5、TaGS-D1等；有的优势等位变异在宁麦系列品种（系）中未检测到，可能是受自然选择与人工选择影响，前人研究证实TaCwi-A1a在南方麦区材料中分布频率很低[35]，TaTGW6-b在现代小麦品种很少检测到[36]，今后可考虑引入这些优势等位变异以进一步提高千粒重。穗粒数相关位点 TaMOC1-7A的优势类型HapH在长江中下游麦区材料中有一定的分布，宁麦9号含有这一优势等位变异，可能是其多粒特性的变异来源之一，但在目前宁麦系列品种（系）中分布较少，今后可加强利用。

宁麦系列品种的品质类型较为丰富，存在弱筋、中筋和中强筋品质类型，并以中筋、弱筋类型为主。分子标记检测结果显示，Pina-D1a/Pinb-D1a基因型比例达到 64.9%，因此，宁麦系列品种（系）多为软质麦。高分子量谷蛋白亚基的组成类型对面筋强度具有较大影响[37]，宁麦系列品种的 Glu-A1、Glu-B1和Glu-D1位点上低面筋强度的亚基类型占有较大比例，与其中筋、弱筋品质类型为主的表型特征是相符的；提升面筋强度的 5+10亚基类型试验材料中也有一定分布，今后需根据不同的育种目标分别加强对高分子量谷蛋白亚基类型的选择。YPC、PPO及 LOX活性均对小麦面制品的外观品质有重要影响[38]，特别是YPC更是与营养品质相关；中国传统主食对面粉白度要求较高，因此多数品种的YPC、PPO及LOX活性均处于较低水平，而随着人们营养和保健意识的提高，亮黄色的面粉和面制品越来越受到重视[39]。宁麦系列品种（系）主要面向传统市场，在营养品质研究方面存在不足。

小麦锈病近年来呈波动性持续上升趋势[30]，本研究与前人研究[40-41]均表明宁麦系列品种极少携带抗锈病基因，今后应加强相关基因的利用，提高品种锈病抗性水平。宁麦系列品种（系）的赤霉病抗性突出，常被用作抗性亲本[42]，宁麦9号还被证实为中国小麦品种中主效抗病基因Fhb1的主要来源[43]。Fhb1在宁麦系列品种（系）中有较高频率的分布，远高于其他区域或单位的材料[44-46]。低水平的白粉病抗性影响了宁麦系列品种在生产中的推广应用[47]，近些年，宁麦系列品种的育种者十分重视白粉病抗性的选择，特别是加强抗性亲本的应用，使白粉病抗性得到较大改善，已有近 30%的高代品系含有主效抗病基因 Pm21。宁麦系列品种（系）主要携带TaSdr-B1与TaVp-1B抗穗发芽基因，TaPHS1的+646和+666功能变异位点在材料中呈现一定分化，总体来说宁麦系列品种（系）穗发芽抗性表现较好，可作为优异亲本使用。

3.3 分子育种体系的建立与应用

在分子育种技术应用方面，宁麦系列品种早期主要针对赤霉病抗性开展分子标记辅助选择，这也是抗病基因Fhb1分布频率较高的主要原因。近年来，本团队一直致力于构建系统的分子育种技术体系，一方面利用现有主效抗病位点，包括抗白粉病基因Pm21、抗条锈病基因Yr26等；另一方面是产量、品质等数量性状相关位点聚合选择体系的建立，包括千粒重、籽粒蛋白含量等性状，目前，已筛选出的多个效应显著的千粒重控制位点[3]，籽粒蛋白含量控制位点的效应评价工作也已完成[48]。此外，还期望通过构建高通量 KASP分子标记选择体系及多重PCR选择体系来应对不同的分析场景，前者主要应用于大规模育种群体的分析，如前人报道的Fhb1的KASP标记[49]，自主开发的Qfhb-5A、Qtkw-1B等[3,14]；后者则是小群体的快速检测，目前，已经成功开发Fhb1与Pm21的多重PCR标记[50]。通过以上分子育种体系的构建与应用，期望提高目标性状选择效率，加速育种进程。