嗜碱假单胞菌Ej2对稻瘟病的防治效果及对水稻内源激素的影响

沙月霞，黄泽阳，马瑞

宁夏农林科学院植物保护研究所，银川 750011

0 引言

【研究意义】稻瘟病（rice blast）是水稻生产上的重要病害，其病原菌有性态为子囊菌门间座壳属灰色大角间座壳 Magnaporthe oryzae（无性态为梨孢属灰梨孢Pyricularia oryzae）[1]。稻瘟病广泛分布于世界各水稻种植地区，其造成的年均产量损失约 20%—30%，流行年份约50%以上，重病田甚至颗粒无收[2]。当前，水稻生产上最主要的措施是种植抗病品种和化学农药防治；但由于品种选育周期较长、稻瘟病菌生理小种易变异，品种抗性易丧失；长期大量的化学农药残留影响生态环境和人类健康，而且导致病原菌产生抗药性。因此，研发安全、有效、绿色的新型生防菌剂对稻瘟病的综合治理具有重要意义。【前人研究进展】假单胞菌（Pseudomonas spp.）具有来源广泛、与环境相容性好、产生多种具有广谱抑菌活性的抗菌物质[3-4]、诱导植株抗病性[5]等特点，一直是植物病害生物防治的研究热点之一。已有的研究报道表明，对稻瘟病菌具有较强拮抗作用的假单胞菌种类包括荧光假单胞菌（P.fluorescens）[6-7]、铜绿假单胞菌（P.aeruginosa）[8-9]、恶臭假单胞菌（P.putida）[10]、类产碱假单胞菌（P.pseudoalcaligenes）[11]和绿针假单胞菌（P.chloroaphis）EA105[12]。关于假单胞菌防治稻瘟病的研究国内外报道较多，主要集中于拮抗作用和防御酶的诱导，对嗜碱假单胞菌（P.alcaliphila）预防稻瘟病的田间应用研究尚处于探索阶段。NG等[8]分离的铜绿假单胞菌UPMP1对稻瘟病菌的抑制率为40.65%，能增强水稻幼苗的过氧化物酶、多酚氧化酶和苯丙氨酸裂解酶活性。植物内生菌由于防病杀虫的生物学活性显著[13-14]兼具促生增产效果[15-16]、提高植株抵抗逆境能力[17-18]、协助寄主吸收营养元素[19-20]、降解重金属和农药污染[21]等特点，广泛用于生物源制剂的研制[22-23]。JHA等[11]研究表明，类产碱假单胞菌GJ17分离于水稻根系组织，对稻瘟病的防治效果高于根际促生菌。【本研究切入点】嗜碱假单胞菌菌株Ej2为笔者课题组从宁夏回族自治区水稻叶片内生菌中获得，其对稻瘟病菌、镰孢菌（Fusarium spp.）等植物病原菌的抑菌活性以及田间应用效果亟需深入研究。【拟解决的关键问题】评价嗜碱假单胞菌菌株Ej2防治稻瘟病的效果及对镰孢菌等病原菌的抑菌效果，探明其发酵液对水稻种子萌发及植株生长的促进效果、对水稻植株胁迫激素及生长激素的影响，为开展稻瘟病、西瓜枯萎病、苹果斑点落叶病等真菌病害的田间防治打下基础。

1 材料与方法

1.1 试验田概况

田间试验于 2020年在宁夏回族自治区灵武市梧桐树乡（106.18°E，37.59°N）和吴忠市金鸡镇（106.14°E，37.94°N）水稻主栽地区进行，属于旱直播种植区，稻瘟病常年发生，行距为30 cm，试验期间正常喷施杀虫剂和水肥管理，不喷施其他杀菌剂。土壤类型是灌淤土，弱碱性（pH 7.8—8.7），有机质17.63 g·kg-1，全氮 1.03 g·kg-1，有效磷 34.19 mg·kg-1，速效钾153.42 mg·kg-1，平均海拔1 133 m，气压88 kPa。供试水稻品种为G19、秋优88和粳谷8号，均为宁夏水稻种植地区主栽品种。

1.2 生防菌、病原菌及其培养

供试生防菌嗜碱假单胞菌Ej2分离自水稻叶片。供试稻瘟病菌 P131由中国农业大学植物保护学院提供；茄镰孢（F.solani）N18-1-2和串珠镰孢（F.moniliforme）N19-2-2由本实验室分离；西瓜枯萎病菌（F.oxysporum f.sp.niveum）M8、草莓炭疽病菌（Colletotrichum gloeospoioides）ZDP21、链格孢苹果专化型（Alternaria alternata f.sp.mali）BJ-A5和草莓黑斑病菌（A.alternata）BJ-ST24由北京市农林科学院植物保护环境保护研究所分离。

供试生防菌在金氏King’s B（KB）固体培养基平板上30℃暗培养2 d，供试病原菌在马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）平板上暗培养7—9 d。

1.3 嗜碱假单胞菌Ej2对病原菌的拮抗作用

将直径1 cm的稻瘟病菌P131菌饼放置在PDA平板中央，28℃暗培养2 d后，测量菌落半径。然后在菌落边缘两侧相距 2 cm的位置接种嗜碱假单胞菌Ej2，划线长度为2 cm，未划线菌株Ej2的平板作为空白对照，所有平板在28℃黑暗培养，5 d后测量不同处理组的病原菌菌落半径和抑菌带。通过菌丝生长速率法测定抑菌效果，计算相对菌丝抑制率。

将直径1 cm的稻瘟病菌P131菌饼放置在PDA培养基的培养皿中央，相同大小的KB固体培养基的培养皿均匀涂布嗜碱假单胞菌 Ej2，前一个培养皿反扣在后一个培养皿上面，两个皿接触位置用封口膜密封严实；未涂布菌株Ej2的处理作为空白对照，每组处理5皿重复。所有培养皿28℃暗培养9 d后，测量两组处理的稻瘟病菌菌落直径，计算嗜碱假单胞菌Ej2产生的挥发性物质对稻瘟病菌的抑制率。

将直径1 cm的镰孢菌等5种植物病原菌的菌饼放置在PDA平板中央，在菌饼两侧距离2 cm的位置接种嗜碱假单胞菌Ej2，划线长度为2 cm，未划线菌株Ej2的平板作为空白对照，所有平板于25℃暗培养，5 d后测量病原菌菌落直径和抑菌带，计算抑制率。

1.4 嗜碱假单胞菌 Ej2对稻瘟病的防治作用及对水稻促生效果评价

挑选健康水稻种子 G19，10%次氯酸钠溶液中浸泡10 min，无菌水冲洗3次。然后分别在嗜碱假单胞菌Ej2发酵液和无菌水中浸泡0.5 h，之后在28℃、相对湿度70%的人工气候箱培养（光照12 h/黑暗12 h），48 h后调查种子露白数量，计算对种子萌发的促进效果。每个培养皿里100粒水稻种子，每个处理3皿重复。

温室种植水稻，试验设计3组处理：嗜碱假单胞菌 Ej2发酵液；无菌水；75%三环唑可湿性粉剂（陶氏益农农业科技（中国）有限公司）。每个处理设计4个重复，每个重复约90株水稻苗。种植20 d的时候喷施菌剂或无菌水，嗜碱假单胞菌Ej2发酵液菌体浓度约1×108CFU/mL（OD600=1.0—1.2），每个处理喷施50 mL。喷施24 h 后，所有试验水稻植株喷施稻瘟病菌孢子悬浮液20 mL，孢子浓度约1×106CFU/mL，7 d后调查叶瘟的发病状况。

田间试验地点在灵武市梧桐树乡和吴忠市金鸡镇，试验设计4组处理：CK为清水对照；嗜碱假单胞菌Ej2发酵液（1×108CFU/mL）；20%稻瘟酰胺悬浮剂，制剂用量为600—750 g·hm-2；芽孢杆菌菌剂（解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）S170和贝莱斯芽孢杆菌（B.velezensis）E69的混合液，本实验室分离获得的稻瘟病生防菌），药液量7.50 L·hm-2（有效活菌数≥1×109CFU/mL）。每组处理设计4个重复大区，随机排列，每个大区试验面积约600 m2。分别在水稻旱直播种植100 d（分蘖期）、120 d（孕穗期）和140 d（破口期）叶面喷施。旱直播种植110 d（分蘖盛期）调查叶瘟的危害，直播后160 d（成熟期）调查穗颈瘟的危害，调查分级标准采用中华人民共和国国家标准（GB/T15970—1995）。水稻收获期采集稻穗，每组处理采集4个小区，每个小区1 m2，测量株高、穗长、穗重和千粒重，评价促生效果。

1.5 嗜碱假单胞菌Ej2对水稻内源激素的影响

1.5.1 样本采集 嗜碱假单胞菌Ej2施药时间、次数与田间试验相同，于收获期采集水稻植株，取中部茎秆，剪成1 cm，无菌水冲洗3次，装入2 mL离心管中，每个离心管0.5 g样本，每个处理7个重复，液氮冷冻后采用干冰邮寄至中科新生命科技有限公司。

1.5.2 待测样本前处理 待测样本采用液氮研磨，然后（80±5）mg样本中加入50 μL内标溶液和1 mL乙腈水溶液（1% FA），振荡2 min混合均匀；4℃黑暗条件下抽提12 h，14 000×g离心10 min，取800 μL上清液用氮气吹干，加入200 μL乙腈水溶液（1∶1，v/v），混合均匀后，再次14 000×g离心10 min，去上清液进行色谱-质谱分析。

1.6 色谱-质谱分析

1.6.1 高效液相色谱条件 代谢上清液分离采用超高效液相色谱系统（Agilent 1290 Infinity LC）。流动相组成包括A相（乙腈水溶液，1% FA）和B相（乙腈）。液相系统条件：柱温40℃，流速为 0.4 mL·min-1，进样量为 5 μL。液相梯度条件：0—20 min，B相从0—90%；20—25 min，B相保持90%；25—27 min，B相从90%—0；27—30 min，B相保持在0。

1.6.2 质谱分析 质谱分析条件：Thermo Scientific TSQ Quantiva，屏蔽气流，30 Arb；辅助气体流，10 Arb；尾气流，8 Arb；碰撞气体，1.5 m Torr；离子连接管温度，350℃；汽化器温度，300℃；喷雾电压，3.0 kV。MRM模式下测试阴阳离子对。

1.7 数据处理

供试生防菌对病原菌的拮抗作用、对水稻生长及稻瘟病预防效果的调查数据在Excel 2016中处理，显著性分析采用DPS15.0统计软件，方差分析选用单因素分析中的最小显著差数法（LSD）计算（P＜0.05）。

计算公式：相对菌丝抑制率（%）=[（空白对照菌丝生长量-处理组菌丝生长量）/ 空白对照菌丝生长量]×100；病情指数＝[∑各级病叶（穗）数×相对级数值]/[调查总叶（穗）数×9]×100；防治效果（%）＝[（CK病情指数-处理病情指数）/CK病情指数]×100。

供试生防菌对水稻内源激素影响的数据采用Thermo Scientific Xcalibur 2.1软件进行分析，依据植物激素标准曲线中的激素含量计算植物内源激素含量。

2 结果

2.1 嗜碱假单胞菌Ej2对稻瘟病菌的拮抗作用

嗜碱假单胞菌Ej2对稻瘟病菌具有显著的拮抗作用，能够明显的抑制菌丝生长，相对菌丝抑制率达到78.57%，其产生的挥发性物质对稻瘟病菌的菌丝生长抑制效果也较为明显（图1）。

图1 嗜碱假单胞菌Ej2对稻瘟病菌菌丝生长的抑制效果Fig.1 The hypha growth rate of M.oryzae P131 inhibited by P.alcaliphila Ej2

2.2 嗜碱假单胞菌Ej2对稻瘟病的防治效果

嗜碱假单胞菌Ej2在温室盆栽条件下对稻瘟病的防治效果较为明显（表 1），对叶瘟的防治效果达到78.26%，与75%三环唑可湿性粉剂的防治效果无显著差异（P＞0.05）。

表1 嗜碱假单胞菌Ej2在温室条件下对稻瘟病的防治效果Table 1 The control efficacy of P.alcaliphila Ej2 against rice blast under greenhouse condition

灵武市的田间防治效果试验表明，嗜碱假单胞菌Ej2菌剂对叶瘟的田间防治效果为75.07%，与芽孢杆菌菌剂的田间防治效果 78.04%无显著差异（P＞0.05），与稻瘟酰胺的田间防治效果64.05%有显著差异（P＜0.05）；嗜碱假单胞菌Ej2菌剂对穗颈瘟的田间防治效果为75.09%，与稻瘟酰胺（74.60%）、芽孢杆菌菌剂（72.76%）的田间防治效果均无显著差异（P＞0.05）（表2）。

表2 嗜碱假单胞菌Ej2防治稻瘟病的田间效果（灵武市）Table 2 The control efficacy of P.alcaliphila Ej2 against rice blast in the field (in Lingwu City)

吴忠市的田间防治效果试验表明，嗜碱假单胞菌Ej2菌剂对叶瘟的田间防治效果为83.67%，与芽孢杆菌菌剂（82.88%）、稻瘟酰胺（81.28%）的田间防治效果均无显著差异（P＞0.05）；嗜碱假单胞菌Ej2菌剂对穗颈瘟的田间防治效果为62.79%，与芽孢杆菌菌剂的田间防治效果 65.46%无显著差异（P＞0.05），与稻瘟酰胺田间防治效果 58.87%有较明显差异（表3）。

表3 嗜碱假单胞菌Ej2防治稻瘟病的田间效果（吴忠市）Table 3 The control efficacy of P.alcaliphila Ej2 against rice blast in the field (in Wuzhong City)

2.3 嗜碱假单胞菌 Ej2对镰孢菌等病原菌的拮抗作用

嗜碱假单胞菌Ej2对镰孢菌等多种植物病原菌具有拮抗作用（表 4），对草莓炭疽病菌、链格孢苹果专化型和西瓜枯萎病菌的抑菌效果介于50%—60%，对串珠镰孢和茄镰孢的抑菌效果在41%—50%，对草莓黑斑病菌的抑菌效果＜20%。这表明菌株 Ej2具有对稻瘟病、土传病害、草莓炭疽病、苹果斑点落叶病等真菌病害的应用潜力。

表4 嗜碱假单胞菌Ej2对多种植物病原菌的拮抗作用Table 4 The antagonist activity of P.alcaliphila Ej2 against various plant pathogens in vitro

2.4 嗜碱假单胞菌Ej2对水稻的促生效果评价

嗜碱假单胞菌Ej2能够显著提高种子萌发率，浸种后的水稻种子萌发率提高了41.67%。嗜碱假单胞菌Ej2对水稻生长具有明显的促生效果（表5）。喷施3次嗜碱假单胞菌Ej2发酵液会增加水稻株高、穗重和千粒重；对株高和穗重的促进效果与芽孢杆菌菌剂无显著差异（P＞0.05），与稻瘟酰胺具有显著差异（P＜0.05）；对穗长的促进效果与芽孢杆菌菌剂、稻瘟酰胺处理之间无显著差异（P＞0.05）；对千粒重的促进效果与稻瘟酰胺无显著差异（P＞0.05），但与芽孢杆菌菌剂有较明显的差异。

表5 嗜碱假单胞菌Ej2对水稻生长的促生效果Table 5 Effect of P.alcaliphila Ej2 on promoting the growth of rice plant

2.5 嗜碱假单胞菌Ej2对植物内源激素的影响

嗜碱假单胞菌Ej2发酵液喷施3次后，水稻植株中的内源激素水平发生变化（表 6）。乙烯和脱落酸含量显著增加；玉米素核苷、反式玉米素核苷和异戊烯基腺嘌呤核苷激素含量显著下降；植物生长素、茉莉酸、顺反茉莉酸类激素、茉莉酸-异亮氨酸、顺式玉米素、反式玉米素、异戊烯基腺嘌呤、水杨酸等激素含量无显著变化。

表6 嗜碱假单胞菌Ej2对水稻内源激素的影响Table 6 Effect of P.alcaliphila Ej2 on the endogenous hormones in rice plant

3 讨论

3.1 嗜碱假单胞菌 Ej2对稻瘟病具有较明显的防治作用并对水稻具有促生效果

假单胞菌防治病害的机制主要包括拮抗作用、营养与生态位点的竞争、有效的根际定殖以及诱导植物系统抗病性[5,10]。假单胞菌具有较明显的防病、促生效果，与环境兼容性好，通常被研制成商品化的生防菌剂[24-25]。但是假单胞菌在生防技术领域应用的菌株种类较少，筛选新的生防资源一直是植物病害生物防治研究的热点之一。

目前，荧光假单胞菌在稻瘟病防治中应用较广，国内外学者关于嗜碱假单胞菌的研究主要集中于脱氮特性及机理研究，国内还未有学者研究过该菌株对稻瘟病菌的拮抗作用，本文研究结果证实了嗜碱假单胞菌Ej2对稻瘟病的防治效果及对水稻的促生效果均较为明显，为稻瘟病新型杀菌剂的研发提供了生防种质资源，也拓展了嗜碱假单胞菌的应用领域。已有的研究表明，植物内生菌受环境因素影响较小，生防效果一般较稳定[13,16]。嗜碱假单胞菌Ej2来源于水稻叶片，研究结果验证了其作为植物内生菌的田间应用效果，具有预防多种真菌病害的应用潜力。

嗜碱假单胞菌Ej2对稻瘟病菌菌落生长具有明显的拮抗作用，产生的挥发性物质对菌落生长的抑菌效果达到了 57.78%，研究结果表明挥发性物质是菌株Ej2的抗菌活性物质之一。筛选和利用具有多种拮抗机制的假单胞菌作为生防菌剂一直是植物病害生物防治的途径之一[26]。从胡椒根部组织中筛选的恶臭假单胞菌 BP25产生的挥发性物质和非挥发性物质对稻瘟病菌菌落生长的抑制率分别达到 71.30%和 37.90%，在水稻幼苗根部具有较强的定殖能力，并增强植株抗病相关防御酶活性[10]。荧光假单胞菌pfr1对稻瘟病菌菌丝抑制率达到76.30%，促生和增产效果显著[25]。本文研究证实了嗜碱假单胞菌Ej2具有广谱抗菌活性，能够有效防治稻瘟病，为应用于稻瘟病的防治提供了科学依据。田间大区试验进一步证实，Ej2可以提高种子萌发并促进植株生长，显示了该菌株具有良好的田间应用价值。菌株Ej2防治草莓炭疽病和西瓜枯萎病等真菌病害的应用效果需要进一步深入验证，但平板拮抗的研究结果表明，该菌株可能具有防治草莓炭疽病和西瓜枯萎病等病害的生防潜力。

3.2 嗜碱假单胞菌Ej2可以调控水稻内源激素表达

植物内源激素对于植株的生长发育至关重要[27-28]，其不仅参与生长发育过程[29-30]，而且调控植株应对生物和非生物等环境胁迫[31-33]。在逆境胁迫下，脱落酸、生长素、水杨酸、茉莉酸、细胞分裂素等植物内源激素往往发生变化，部分激素自身合成的能力会受到抑制[34-35]。脱落酸、水杨酸、茉莉酸是常见的胁迫激素，其中脱落酸在逆境胁迫下含量会增加，气孔开闭被调节以减少植株内的水蒸腾量[36-37]。本研究检测了嗜碱假单胞菌Ej2发酵液喷施3次后水稻植株中的激素含量变化，结果表明喷施Ej2显著增加了脱落酸和乙烯的含量，降低了玉米素核苷、反式玉米素核苷和异戊烯基腺嘌呤核苷激素含量。植物胁迫激素含量与植株抗逆性密切相关，随着脱落酸和乙烯的含量增加，植株抗逆性也提高。研究结果间接说明Ej2发酵液喷施3次能够提高水稻植株抗逆性。玉米素核苷、反式玉米素核苷和异戊烯基腺嘌呤核苷等细胞分裂素负调控植物根与茎的生长，本研究中3种激素含量下降，说明Ej2喷施3次后能促进水稻根系和茎的生长。基于MRM方法的靶向代谢组学技术具有高灵敏度、高分辨率、高准确性等优点，被广泛用于植物激素的定量检测。本研究结果表明，可以采用MRM方法的靶向代谢组学技术研究嗜碱假单胞菌对植物生长激素的影响。

4 结论

嗜碱假单胞菌 Ej2对稻瘟病具有较好的防治作用，对多种植物病原真菌兼具抑菌活性，可以明显促进水稻种子萌发和植株生长，在水稻产业可持续发展中具有推广应用潜力。菌株Ej2发酵液连续喷施3次后，能够显著增加植株内的胁迫激素脱落酸和乙烯水平，降低玉米素核苷、反式玉米素核苷和异戊烯基腺嘌呤核苷水平。因此，嗜碱假单胞菌Ej2是一种潜在的、有效的生防菌株，兼具防治稻瘟病、炭疽病、苹果斑点落叶病、草莓黑斑病和镰孢菌引起的土传病害的潜力。