基于CRISPR技术的β-地中海贫血基因编辑的研究进展

贾吉宏，王春芳

(1.右江民族医学院附属医院检验科，广西百色 533000；2.右江民族医学院研究生学院，广西百色 533000)

β-地中海贫血(简称β-地贫)是因β-珠蛋白链缺失引起溶血和无效红细胞生成的单基因遗传病。正常情况下，胎儿在出生时γ-珠蛋白基因沉默，而成年β-珠蛋白基因开始表达。若胎儿γ-珠蛋白基因终身持续表达，便可缓解因β-珠蛋白基因缺乏而引起的贫血。因此治疗性的激活γ-珠蛋白基因成为研究的重点。规律间隔成簇短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)系统自2012年至今发展迅猛，并在治疗地中海贫血的研究中取得了显著成果。使用CRISPR/Cas9基因编辑技术、碱基编辑技术(base editor，BE)和引导编辑技术(prime editor，PE)纠正β-地贫患者造血干细胞(hematopoietic stem cells，HSCs)中的突变已被认为是有效产生血红蛋白的新型治疗方法。然而，基因编辑有其优势的同时，也存在一些缺点。故本综述的重点是阐述目前最先进的CRISPR技术在治疗β-地贫中的研究进展，并比较它们在使用过程中的利与弊。

1 CRISPR技术在β-地贫中的应用

血红蛋白是一种携氧四聚体蛋白，由两条类β-珠蛋白基因和两条类α-珠蛋白基因(HBA1 和 HBA2)组成。α-珠蛋白簇由三个基因(ζ、α2、α1)组成，β-珠蛋白簇由五个基因(ε、Gγ、Aγ、δ和β)组成。孕早期，ε-珠蛋白基因沉默，γ-珠蛋白基因(HBG1/HBG2)活化，并与α-珠蛋白配对形成胎儿血红蛋白(fetal hemoglobin，HbF)；胎儿出生时，γ-珠蛋白基因几乎完全沉默，β-珠蛋白基因活化与α-珠蛋白基因配对形成成人血红蛋白(HbA)并在成人期持续表达。当β-珠蛋白基因发生突变时，未配对的α-珠蛋白链相对过剩并沉积在红细胞膜上形成有毒的不溶性内含物，造成溶血或无效红细胞生成，最终引起β-地贫。

携带β-珠蛋白基因的新一代慢病毒载体在HSCs中已显示出有效的转导作用[1]。使用不同类型的慢病毒载体进行细胞转导已应用于治疗β-地贫和镰状细胞病(sickle-cell disease，SCD)的多项临床试验中，这些临床试验的初步结果显示：血红蛋白的持续生产、输血需求的降低、生活质量的提高[2-3]。但其风险在于，在非靶点上半随机地将转导基因整合到基因组这个过程，容易产生异常转录引发肿瘤[4]。而基于CRISPR的基因组编辑技术可修饰单个基因组目标，并具有更高的编辑特异性。2020年，使用CRISPR技术首次成功治愈了β-地贫和SCD这两种遗传性血液病[5]。随着基因编辑工具的进步，CRISPR/Cas9基因编辑技术、BE及PE相继被人类发现，并在治疗遗传性疾病中得以广泛应用。CRISPR/Cas9技术的设计过程简便、编辑效率高且成本相对低廉，但仍存在较高的脱靶效应(OFE)，即由于靶序列的同源性，Cas9在非预期位点进行切割。现已经开发了多种减少或消除OFE的策略，包括设计合理的Cas9高保真变体[6]和优化的靶标设计[7]。CRISPR介导的碱基编辑技术是一种通过靶向改变单核苷酸变异或点突变来达到纠正致病突变的技术，它的主要优点是可以在不产生DNA双链断裂的情况下化学修饰目标序列的核苷酸碱基，减少了插入或缺失引起的突变。但在纠正多碱基突变引起的遗传性疾病方面仍具有局限性。此时，一个新的精准基因编辑技术能够有效实现多碱基之间的精准插入和删除，且无需额外的DNA模板即可完成12种单碱基的自由转换。它就是引导编辑技术，是基因编辑领域的重要革新，成为治愈地中海贫血的最有前景的技术。

1.1 利用CRISPR/Cas9再激活γ-珠蛋白基因上调HbF水平胎儿γ-珠蛋白基因通常在出生时被成年β-珠蛋白基因取代，完成胎儿到成人的“血红蛋白开关”转换[8]。若干预上述这一转换，使γ-珠蛋白基因在患儿出生后仍持续存在，恰好弥补了β-珠蛋白基因的缺失或突变，并阻止过量未配对的α-珠蛋白链的沉淀和β-地贫中的无效红细胞生成。目前，再激活胎儿 γ-珠蛋白基因成为治疗β-地中海贫血的研究热点。

B细胞淋巴瘤因子11A(B-cell lymphoma 11A，BCL11A)作为γ-珠蛋白基因沉默的主要调节因子，是上调HbF水平的有希望的靶标。CTX001是一种使用CRISPR/Cas9修饰自体CD34+造血干/祖细胞(HSPCs)降低BCL11A基因表达的产品，正在输血依赖型β-地贫患者中进行研究。这项临床试验报道了一名输血依赖型β-地贫女性患者接受了CTX001，其 HbF 水平持续升高并开始不依赖输血，且未检测出脱靶效应[9]。但在随访过程中出现了包括中性粒细胞减少症、肝窦阻塞综合征/肝小静脉闭塞病、肺炎和淋巴细胞减少症等不良反应。为解释其原因，进一步发现BCL11A不仅调节造血干细胞的自我更新，而且影响B淋巴细胞的成熟和中枢神经系统的发育[10]。BCL11A 基因座包含三个DNase I超敏反应位点(DHS)，它们作为红细胞特异性增强子，位于距转录起始位点+62、+58和+55 kb处[11]。+58处的DHS对于表达含有GATA1基序的基因至关重要，并且参与红系谱系的形成[12]。使用 CRISPR/Cas9技术编辑HSPCs中+58 BCL11A红系增强子的GATA1结合位点，可以减少BCL11A 在红系谱系细胞中的表达，而不影响其他细胞内BCL11A水平，并促进γ-珠蛋白的合成，重新激活HbF的产生[13]。生物学家正计划将BCL11A增强子编辑策略用于行业赞助的临床试验中。在临床分级、细胞产品生产的扩大方案和进行安全性研究方面有一定的进展，开始了β-地贫基因治疗的临床试验[14]。

另一种途径是通过模拟遗传性持续性胎儿血红蛋白综合征(hereditary persistence of fetal hemoglobin，HPFH)的相关突变来诱导HbF内源性表达。HPFH是一种良性疾病，表现为出生后γ-珠蛋白基因仍持续表达。当β-地贫合并HPFH时，γ-珠蛋白基因的重新激活使HbF水平升高，改善了α/β-珠蛋白链之间的不平衡，表现出较轻的临床症状[15]。研究表明[14]，γ-珠蛋白基因启动子上存在很多HPFH突变，其中位于转录起始位点上游约115 bp和200 bp区域的γ-珠蛋白基因启动子的点突变与HbF水平升高有关。WANG等人[16]利用CRISPR/Cas9技术编辑CD34+HSPCs中BCL11A结合的HBG1/HBG2基因启动子基序，产生γ-珠蛋白mRNA表达增加，并提高了红系细胞分化率，且没有检测到脱靶突变效应。他们还发现了BCL11A 结合位点(TGACCA：-114至-119)对抑制γ-珠蛋白链至关重要，是碱基编辑器hA3A-BE3诱导突变和促进γ-珠蛋白基因表达升高的理想靶点[17]。使用电穿孔技术通过Cas9:sgRNA和hA3A-BE3:sgRNA RNP模拟HPFH患者HBG1基因启动子(102～114)自然发生的13 bp等位基因缺失和-114 C>T，证明了源自β-地贫患者HSPCs中的HBG启动子编辑破坏了BCL11A结合域，使γ-珠蛋白再激活[16]。近日，LIN等人[18]确定了TEA 结构域转录因子4(TEAD4)在γ-珠蛋白基因启动子上的结合基序，它是通过直接与HBG启动子结合来抑制γ-珠蛋白转录活性。研究使用CRISPR/Cas9破坏人脐带血来源的红系祖细胞系(human umbilical cord blood derived erythroid progenitor 2，HUDEP2)细胞中 HBG 启动子上的TEAD4结合位点，检测到的γ-珠蛋白表达显著增加的同时未观察到红系分化的显著差异。

其他几种转录因子，包括 Krüppel样因子1(KLF1)、SOX6、MYB等，在从胎儿血红蛋白到成人血红蛋白的转换过程中起调节作用。KLF1可通过直接激活β-珠蛋白基因和间接抑制BCL11A水平以增加γ-珠蛋白基因表达这两种方式来治疗β-地中海贫血。并且有研究表明[19]，通过敲除KLF1基因抑制BCL11A比直接靶向BCL11A增强子所产生的HbF水平上调更加明显，可高达25%，且未检测到脱靶效应。但因其敲低所产生的不良影响，不建议作为β-地贫的潜在性治疗途径。SOX6作为抑制γ-珠蛋白基因的重要因子，SHARIATI等人[20]利用CRISPR/Cas9技术靶向敲除SOX6，有效上调HbF水平，充分证明了SOX6可作为β-地贫治疗的靶点。MYB是红系发育和HbF水平的关键调节调节因子。它通过激活人红细胞中的KLF1和TR2/TR4，间接激活BCL11A基因，是一种强大的 γ-珠蛋白基因抑制因子[21]。上述通过CRISPR/Cas9基因编辑技术编辑BCL11A红系增强子和HBG1/HBG2启动子 TGCAAC基序能够独立诱导HUDEP2细胞中γ-珠蛋白基因的表达，表明单基因编辑是有效的，但它仍然存在一定的局限性。最近，HAN等人[22]提出了应用CRISPR/Cas9的多重基因组编辑策略编辑 HUDEP2细胞系和人外周血衍生的造血干细胞中BCL11A和γ-珠蛋白基因启动子TGCAAC基序的DHS +58/祖细胞(HSPCs)，同时下调BCL11A表达并破坏γ-珠蛋白启动子上的BCL11A结合位点，最终导致HbF水平表达更高。同时首次评估了多重基因编辑的脱靶事件，证明了多重基因编辑在HSPC中是有效且安全的，进一步拓宽了基因编辑治疗β-地中海贫血的道路。

1.2 利用CRISPR/Cas9下调α-珠蛋白基因纠正α/β-珠蛋白链失衡β-地中海贫血无效红细胞生成和溶血的主要原因是α-珠蛋白链相对过剩，过量的游离α-珠蛋白形成有毒沉淀物沉积于红系前体细胞，触发级联事件产生活性氧。因此，β-地中海贫血患者中α-珠蛋白基因表达的下调可以改善甚至治愈β-地中海贫血。

临床数据表明，β-地贫的严重程度与α-珠蛋白基因数量有直接关系，α-珠蛋白基因缺失明显减缓了β-地贫患者的临床症状及输血需求[23]。最近的一项体外研究报道了使用CRISPR/Cas9基因组编辑技术删除HBA2下调α-珠蛋白基因，重建α-地中海贫血性状[24]。在这项研究中，研究人员设计了一种单向导RNA来靶向HBA1和HBA2基因的5'UTR，从而去除HBA2基因，显示出α-珠蛋白基因mRNA的显著减少和红系细胞中的α-珠蛋白沉淀物的明显减少，同时能够保证足够的血红蛋白的合成。另一种下调α-珠蛋白基因的方法是敲除人CD34+细胞的MCS-R2 α-珠蛋白增强子，使α/β-珠蛋白链失衡恢复到正常水平。METTANANDA[25]通过试验证明β-地贫患者红系细胞中MCS-R2增强子的单等位基因缺失后可导致60%以上的α-珠蛋白链合成被敲低；MCS-R2增强子的双等位基因缺失可导致约90%的α-珠蛋白链合成被敲低。为了更有效地纠正α/β-珠蛋白链失衡，PAVANI等[24]通过删除HBA2基因来模拟α-地贫特征并在内源性HBA启动子的控制下靶向整合和表达了β-珠蛋白转基因，这种协同编辑使得α-珠蛋白下调的同时伴随着β-珠蛋白的上调，高效改善了β-地贫患者红系细胞中α/β-珠蛋白链的失衡。CROMER 等人[26]使用组合Cas9/AAV6基因组编辑方法将内源HBA1基因转换为β-珠蛋白转基因。尽管基因组编辑频率低于预期水平，但仍显示出可喜的结果。此外，若将下调α-珠蛋白的基因编辑方法与上调HbF的基因编辑技术相结合，以产生累加效应，可能成为更有效的治疗β-地中海贫血的协同编辑方法。

1.3 碱基编辑技术相比随机切断基因序列，直接纠正异常基因点突变是改善疾病影响的理想方法。Liu的团队在2016年报告了一种新的基于CRISPR的基因编辑方法：碱基编辑技术[27]。它可以在不需要进行双链DNA断裂的情况下用化学方法把一个碱基字母直接替换成另一个。BE已经用于纠正由单碱基点突变引起的遗传疾病，包括最常见的SCD和β-地贫[16]。据研究发现，BE主要是通过模拟γ-珠蛋白基因启动子上-198和-175 HPFH突变或通过精确的碱基替换破坏BCL11A增强子中的GATA1基序来上调HbF水平[28]，从而达到治疗疾病的效果。并且Cas9直系同源物和工程变体的更新扩展了BE的靶向范围[29]，使用新的工程变体能够靶向HBG启动子中的两个区域[28]，但同时可能产生中间序列缺失的风险。脱氨酶的修饰减少了旁观者编辑，产生更精确的BE，具有更高的产品纯度和更窄的活性窗口[30]。然而，单碱基编辑技术在纠正多碱基突变引起的遗传疾病方面仍具有局限性。

1.4 引导编辑技术ANZALONE等人[31]开发了一种用于单碱基编辑的改良CRISPR/Cas9系统：引导编辑技术。PE是一种“搜索和替换”基因组编辑技术，它可以在不需要dsDNA断裂或供体DNA模板的情况下，在人类细胞中介导有针对性的靶向插入、删除以及进行任何可能的碱基间的转换[31]。PE使用催化受损的Cas9内切酶与工程逆转录酶聚合，并通过引导编辑向导RNA(pegRNA)进行编码。pegRNA可以指定靶点，而且不需要dsDNA断裂或供体DNA模板就能编码所需的编辑片段[31]。由于PE可以在靠近或远离原间隔相邻基序(proto-spacer adjacent motif，PAM)的位置进行编辑，而不像其他方法那样受到PAM的限制，所以它扩展了CRISPR基因组编辑的范围。目前的研究已经对人类细胞进行了175种不同的DNA编辑，纠正了SCD的突变、移除了萨氏病基因中多余的致病碱基等。在此之前，没有任何方法能够不留下插入、缺失和其他可能干扰编辑细胞工作的基因碎片，还在如此多不同的细胞类型中进行如此广泛的DNA改变[31]，为β-地贫的治疗提供了新的方向。到目前为止，研究人员只对少数人类细胞类型进行了实验，在PE应用于人类之前，还需进一步证明其安全性和有效性。

2 CRISPR基因编辑技术的利与弊

与 CRISPR/Cas9核酸酶系统相比，BE的主要优势之一是它们能够在不产生DSB的情况下引入精确的点突变。BE有效地纠正了人类细胞系中特定的碱基，但对于直接纠正SCD和神经节苷脂沉积病中常见的重要颠换及多个碱基的插入或缺失等方面存在限制。而PE解决了BE面临的一些问题，如提高效率、精确的靶向插入和删除、全部12种可能的碱基间的转换等。但BE在最佳窗口效率要高于PE。当碱基编辑窗口中存在多个胞苷或腺嘌呤碱基，或者无法正确定位的PAM时，使用BE可能会发生不必要的旁观者突变[32]。当无法接受旁观者突变或者目标靶点缺少PAM时，PE与BE差别不大。在没有旁观者突变的情况下PE的效率高于BE。因此，对于存在多个胞嘧啶或腺嘌呤的目标基序且不希望出现旁观者突变时，PE具有很大的优势。另外，使用Cas9和pegRNA进行 PE复合修饰靶点的效率与使用sgRNA的CRISPR/Cas9相似，而PE修饰脱靶位点的效率比使用CRISPR/Cas9降低了4.4倍[33]。PE并不能像CRISPR/Cas9那样完成大范围的DNA插入或删除。因此，它目前依然无法完全取代其他的基因编辑工具。

3 小结与展望

基于CRISPR技术的基因编辑在β-地中海贫血的治疗中具有良好的前景。尽管新的CRISPR工具不断涌现，但它们在人类造血干细胞中应用仍然较少，CRISPR/Cas9仍然是主导的基因工程工具。但CRISPR存在的脱靶效应、DNA损伤后的细胞毒性，以及免疫原性仍然是主要的限制因素。为了提高CRISPR编辑人类干细胞的效率和安全性，同时为体内目的优化输送/移植，仍需要研究关键步骤。因此，在将其安全地应用于人类之前，需要进行更多的研究。但CRISPR技术充分发挥其潜力也只是时间问题。