新疆黑槌虫草羽束梗孢菌的液体深层发酵控制

张慧涛，王志方，侯新强

(新疆农业科学院 微生物应用研究所/新疆特殊环境微生物实验室，新疆 乌鲁木齐 830091)

新疆黑槌虫草生长在新疆北疆阿尔泰山山区，分布于海拔1 250～2 000 m半阴半阳坡，是全年均可采收的新疆特色虫草物种，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、免疫调节和肾脏保护性等生物活性[1]，但人工模拟新疆黑槌虫草天然生长环境难度较大，难以获得黑槌虫草。我所从天然新疆黑槌虫草菌核组织中分离培养出性状优良且稳定的羽束梗孢菌株：CGMCC新槌12，并采用液体深层发酵方法生产新疆黑槌虫草羽束梗孢菌菌丝体，然后再将发酵液制成菌粉和发酵滤液。发酵生产的羽束梗孢菌菌粉主要成分与天然黑槌虫草基本相同，亦与青海产冬虫夏草相当[2]。毒理和药理研究表明，菌粉和发酵液安全无毒，滤清液与天然虫草的浸出液一样，味苦而纯正，适合口服。

黑槌虫草羽束梗孢菌发酵生产属于菌种的纯种培养过程,如果发酵过程中发现有其他微生物存在，就视为染菌。导致染菌的原因很多，均会导致发酵失败。黑槌虫草羽束梗孢菌发酵周期较长，在每级种子罐要生产7 d以上，逐级转到最终发酵罐后则要发酵2周左右，如此长周期的发酵如果存在杂菌很容易造成发酵失败。经过多批次的发酵，我们总结了羽束梗孢菌的发酵控制技术，将黑槌虫草发酵成功率从最初不到50 %提高到目前的90 %以上。笔者从发酵的配套装备和发酵过程控制方面分析黑槌虫草羽束梗孢菌的发酵控制。

1 发酵装备的关键点和相关改进

发酵罐在使用之前,需要认真检查,以消除设备隐患,还要重点注意以下几个方面。

1.1 发酵罐机械密封

机械密封目前在发酵罐上得到广泛应用，利用机械密封动静环的旋转摩擦密封取代了以前搅拌轴填料函密封形式。由于动静环的旋转摩擦需要润滑，通常采用无菌水润滑动静环接触旋转部位，但是黑槌虫草羽束梗孢菌发酵周期较长，在自然蒸发和发酵罐上搅拌电机散热风扇的风力共同作用下，润滑的水容易蒸干，如果值班人员没有注意，动静环旋转摩擦时会发出异响和振动，导致密封失效而发生泄露，很容易造成发酵染菌。为此，我们在发酵罐的动静环接触旋转部位用甘油代替了无菌水，在发酵罐进行实消时将固体甘油抹在动静环接触旋转部位边上，利用发酵罐实消时的热量将甘油融化，渗入动静环，等到发酵罐实消结束后仍然有油膜留在动静环接触面上，从而实现良好润滑。

经过黑槌虫草数批次的发酵，证明此方法简单可靠，降低了值班人员的操作失误，提高了发酵成功率。

1.2 管道

管道的连接一般有焊接、螺纹连接和法兰连接三种，在我所发酵中试车间，法兰连接是发酵管道连接的主要方式。法兰之间一般均采用石棉垫片，但是黑槌虫草的发酵产物由于可以作为食品或药品使用，法兰之间不能采用有毒的石棉垫片。因此凡是能够与发酵液接触的管道连接法兰垫片都更换成了聚四氟乙烯垫片。这种材料无毒、耐高温、耐腐蚀、有弹性、不吸水，除了价格高外十分适合发酵行业。但聚四氟乙烯垫片高温时在法兰紧固螺栓的作用下，会发生塑性变形，使法兰紧固螺栓松动，导致法兰连接不紧密而泄露。因此在法兰经过高温蒸汽之后，必须要重新紧固连接螺栓。

发酵罐内一般设置有视镜来观察发酵液的情况，在罐内也配有相应冲洗透镜的的蒸汽管道，蒸汽如果冷凝在管道中，就失去了灭菌能力，为消除黑槌虫草羽束梗孢菌的染菌隐患，应去除这类蒸汽管道。

1.3 空气净化系统

目前国内的膜过滤技术比较成熟，用聚偏二氟乙烯(PVDF)制成的折叠微孔滤膜滤芯，过滤精度可达0.01μm，过滤效率高，高流速高通量，,疏水性强，可反复热压消毒，在工业领域大量使用，已经替代了传统的活性炭、棉花、超细玻璃纤维为过滤介质的过滤器。

如果空气过滤器的除菌质量不好，将会使过滤后的空气含有杂菌，如果杂菌数量很少，采用间断取样检测不容易检测出来，误以为空气质量合格，容易造成发酵失败。针对黑槌虫草发酵，采用了连续空气检测方法，在最后一级的过滤器后挂了一个空气测样瓶，瓶中是灭菌后不接种的LB细菌培养基，连续通入过滤后的空气。只要观察到培养基保持清澈，就说明过滤器运行正常。如果发酵罐发生染菌，我们也可以据此判断染菌原因，采用正确的处理方式。在黑槌虫草羽束梗孢菌发酵中车间各级发酵罐的过滤器连续使用2个月，镜检空气测样瓶无菌。

在系统的总空气过滤器前，应设置前置空气过滤器，对出自空压机的空气进行脱油、脱水和部分除菌，以减轻总空气过滤器的压力。对于每一个发酵罐，应配备独立的可灭菌的空气过滤器。

1.4 阀门

阀门在发酵设备中使用最多，采用的阀门也有各种型号，有条件的发酵车间使用专用的二通阀或隔膜阀[3]。考虑到阀门使用成本和易于维护，在我所中试车间用的最多是截止阀，发酵阀门对密封的要求高，使用中开闭比较频繁，对内部密封副的磨损较大，普通的密封结构不适用发酵，因此针对发酵特点对内部密封副进行了改进，将原截止阀的硬密封密封副改成了软密封，密封关闭件用聚四氟乙烯垫片。由于聚四氟乙烯材料较软，垫片可以自行加工，通过更换聚四氟乙烯垫片来保证阀门的密封。避免由于密封副泄露而整体更换阀门，即降低了发酵染菌风险也大幅降低了成本。

发酵阀门也要密切注意阀门外密封泄露，对于截止阀，从阀杆处发生的泄露是外密封泄漏。在发酵生产中，阀门的外密封泄漏比较隐蔽，阀门外密封检查容易忽略，如果不加以注意，很容易造成发酵染菌。在黑槌虫草羽束梗孢菌发酵前对关键阀门逐个进行密封性检查，并用新型膨胀聚四氟乙烯密封填料替代了常规的石棉和膨胀石墨填料，该填料耐磨耐腐蚀，密封效果比常规的石棉和膨胀石墨填料要好。

2 发酵过程控制

2.1 灭菌时间的控制

发酵灭菌是利用高温湿热蒸汽进行灭菌，利用高温湿热蒸汽的热量使微生物细胞内的蛋白质发生不可逆的凝固变化，在很短的时间内造成微生物的死亡。一般常温微生物在60 ℃、10 min就可以死亡，而芽胞杆菌的芽孢能耐受较高温度，100 ℃有时数小时才能杀死，因此一般衡量灭菌的彻底于否，是以能否杀灭芽胞杆菌为标准[4]。灭菌温度越高，灭菌时间越长，灭菌的效果越好，但是又不能任意提高灭菌温度和延长灭菌时间，否则培养基的有效成分遭到较大破坏[5](灭菌温度和时间对养分破坏的比较见表1)，影响黑槌虫草羽束梗孢菌的生长，得不到我们需要的合格菌丝体。

表1 灭菌温度和时间对养分破坏的比较

由于黑槌虫草培养基中有豆类粉末，不易灭菌，经过实验，我们确定黑槌虫草发酵的灭菌温度控制在115 ℃，时间控制在40 min，即可以保证灭菌质量，又不会损失过多的营养成分。

2.2 发酵参数控制

黑槌虫草羽束梗孢菌发酵中控制的参数有温度、罐压、排气流量、搅拌速度、pH、溶氧、泡沫等，由于羽束梗孢菌的生长对氧气需求不大，在现有的通气条件下，溶氧基本保持不变，因此为避免增加染菌风险和保护电极，溶氧电极可以不用放置。羽束梗孢菌的生长对温度变化要求不高，发酵时温度的控制方式用开关控制即可。其他部分控制参数见表2。

表2 部分发酵罐的控制参数

发酵液的pH在黑槌虫草发酵中用于监测羽束梗孢菌的生长是否正常，如果发酵液pH值在发酵中基本保持不变，说明羽束梗孢菌生长正常，如果发酵液pH值出现向上或向下的趋势，则此次发酵极有可能染菌。对黑槌虫草的发酵而言，还可以通过发酵排气的味道来判断是否染菌和发酵情况，在正常情况下，排气没有任何异味，如果出现酸味等异味，则说明已经染菌，而在发酵后期，当出现微微的苦味时，则意味羽束梗孢菌生长到了末期，这时取样，发现发酵液变成澄清透明的淡棕黄色，味苦无异味，镜检菌球直径2～3 mm，大小均匀，发酵液残糖检测不超过0.5%，可终止发酵，菌丝体的得率可达2.5%。

发酵产生的泡沫一直是造成染菌的重要原因[6]，由于培养基中的豆类成份和黑槌虫草羽束梗孢菌发酵过程中代谢产物均会产生泡沫，如果不能把泡沫压制在罐中，一旦与外界空气接触，极易造成染菌导致发酵失败，因此减少泡沫产生也是黑槌虫草羽束梗孢菌发酵的重点防控措施。黑槌虫草发酵产生泡沫主要在两个阶段，第一阶段是在发酵液灭菌时，发酵液沸腾产生泡沫，灭菌时一定要控制泡沫不能冲出罐外造成逃液。由于黑槌虫草羽束梗孢菌的特殊性，培养基中不能加入工业消泡剂，而市场上的食品消泡剂又对羽束梗孢菌的品质和生长造成影响，黑槌虫草发酵采用食用豆油作为消泡剂，但是效果不如工业消泡剂，而且为了不影响羽束梗孢菌的生长也不能多加，这就对灭菌操作提出较高要求。这时应该对培养基进行预处理，提前在罐外对培养基煮沸，将培养基中的发泡物质消耗一部分，再进行罐内发酵液灭菌时会显着降低泡沫量。第二阶段发酵液产生泡沫是在羽束梗孢菌发酵过程中，随着培养基养分的消耗，羽束梗孢菌生长导致自身代谢产物增加，发酵过程中会出现泡沫。对于种子罐的泡沫一般采取调整发酵参数，例如降低搅拌速度，降低进气流量和适当提高种子罐的罐压力来解决，如果种子罐泡沫控制困难时，应及时转入下一级种子罐，这样逐级放大，一直到最后一级的发酵罐，而在最后一级的发酵罐中，除了采用调整发酵参数来控制泡沫外，还可以通过无菌管道加入经灭菌的食用豆油来控制泡沫。

2.3 接种、移种和取样控制

黑槌虫草羽束梗孢菌的菌种接入采用火焰封闭接种口，然后快速导入菌种的方式，接种环节十分关键，接种过程中如果接种口火焰未能全部封闭接种口，或者火焰受到干扰，以及菌种沾在了接种口上，均增加了染菌的风险。因此在接种前提前用紫外灯对环境杀菌，接种时关闭门窗，用酒精擦拭接种口，检查火焰接种环，打开排气阀排气，罐内残余有微弱压力是关闭排气阀，注意关闭排气阀的时间，过早关闭排气阀会使罐内残余气流过多，接种口打开时气流冲出会吹灭火焰，过晚关闭排气阀会使罐内压力跌零增加染菌风险。接种口打开后立即稍开进气阀门，使发酵罐保持微弱正压，接种时避免受到环境气流干扰，快速倒入。

发酵生产是一个逐级放大的过程，当种子罐中黑槌虫草羽束梗孢菌生长到稳定期，即可进行移种操作。如果罐和罐之间有固定管道连接则相对容易，管道用150～200 kpa蒸汽灭菌30 min并保持正压。如果发酵罐之间没有设计管道连接，这时可以用硅胶管作为临时的移种管道，移种硅胶管的管壁厚度应在1 mm以上，各罐的附属蒸汽管道粗细不同时，宜使用较粗蒸汽管道的蒸汽作为灭菌蒸汽，硅胶管内部的流通蒸汽压力保持150 kpa以上，灭菌时间30～40 min。

为了掌握羽束梗孢菌的生长情况，确定移种时间，发酵过程中要适时取样，但同时也增加了染菌风险，因此操作人员必须严格取样操作。取样管道灭菌时灭菌蒸汽必须连续流通，不容许出现死点。由于发酵生产中，有些阀门安装时其标注流向与发酵液流向是相反的，这时需在该阀门的底部加装一个小的附加阀门使蒸汽流通。要加强对取样阀的外密封结构的检查，防止发酵液从外密封结构中泄漏，造成发酵染菌。

发酵灭菌时只有蒸汽流通才有灭菌的效果，对不流通的管道、阀门，必须采用上文方式改造使蒸汽流通。然后无菌空气保持正压，避免杂菌侵入。

总之，可能导致新疆黑槌虫草羽束梗孢菌发酵失败的原因很多，主要有设备泄露、空气带菌、灭菌不透，操作不当等，发酵后期的染菌将使前期的工作前功尽弃，给生产造成很大损失，这就要求我们在发酵生产中，对发酵生产的每一个环节严加控制，既要做好常规检查，也要做好专项防控，杜绝发酵染菌的隐患。