老瓜头不同极性段的杀虫活性

王 梅, 王亚文, 贺 英, 李 刚, 景 瑞, 阎雄飞

(榆林学院 生命科学院, 陕西 榆林 719000)

老瓜头(CynanchumkomaroviiAl. Lljinsk)又名牛心朴子、牛心朴子草、华北白前、对叶子草等，是萝藦科(Asclepiadaceae)鹅绒藤属(Cynanchum)一种生长于我国西北荒漠和半荒漠地区的重要有毒沙生植物之一，主要分布在内蒙古自治区、宁夏回族自治区、新疆维吾尔自治区、陕西、甘肃和青海等地的荒漠和半荒漠地区，是草场退化和土地沙化的重要标志性植物之一[1]。老瓜头作为一种有毒植物，由于具有耐寒、耐旱、耐瘠薄、繁殖快等特性，在干旱少雨等恶劣天气情况下，大面积成片繁殖生长，挤占优良牧草的生态位，抑制牧草的正常生长，严重影响了当地牧民放牧和草场经济的健康发展[2]。因此，对老瓜头毒草资源进行科学合理的开发和利用，对保护牧草资源、恢复草场经济生产力和防止沙漠化具有重要的意义。

植物源农药的提取物大部分是多成分共同作用，且作用的方式多种多样，在自然环境下非常容易降解；对于靶标害虫来说，不容易对农药产生抗药性，且对天敌等非靶标生物相对安全[3]。此外，利用植物根、茎、叶等材料加工的农药具毒性相对低、残留相对少的优点，植物源农药将有毒植物器官中具有杀虫、杀菌、除草等具有生物活性物质(生物碱、萜类、黄酮类、菊酯类、精油类等)等提取出来，并将这些物质通过选择直接或间接加工成新的农药[4～8]。加之我国植物源农药资源丰富，因此，兼具有取材方便，成本低廉等优势，越来越受到人们的重视和关注。

二十一世纪以来，随着分析化学和植物化学等科学技术的日新月异，老瓜头具有抑菌[9～12]、除草[13～14]、杀虫除螨[15～21]等多种生物活性逐渐被科研工作者发现和证实。老瓜头生物活性成分分离鉴定和作用机理的分析阐明，老瓜头作为重要的植物源农药资源而成为研究的热点。近年来，随着人们对农产品和环境安全的日益重视，绿色植保逐渐融入人们的理念。鉴于此，开发和利用沙区有毒植物老瓜头作为植物源农药，不仅可以解决该植物的资源合理利用问题，还为开发和研究老瓜头为主的新植物源农药提供新的资料，进而给我国西北荒漠地区带来较高的经济、社会和生态效益。

1 材料与方法

1.1 材料

供试药物：2017年4月于陕西省榆林市佳县朱家坬镇采摘老瓜头全株若干，带回榆林学院植物保护实验室。将老瓜头全草置于50℃的恒温干燥箱中干燥至恒重。进行充分干燥后，使用40目粉碎机粉碎，将老瓜头粉末放入密封袋中备用。阳性对照药物为银黄颗粒，购自成都神鹤药业有限责任公司。

供试昆虫：粘虫(Mythimnaseparata)、枣飞象(Scythropusyasumatsui)、山楂叶螨(Tetranychuscinnbarinus)和小地老虎(Agrotisypsilon)均由榆林学院生命科学学院提供。枣飞象供试虫态为成虫，山楂叶螨为成螨，粘虫、小地老虎均为3龄幼虫。试验中选取大小、形态一致的昆虫备用。

仪器与试剂：JK-450数控超声波清洗仪；GZX-9070数显鼓风干燥箱；SHZ-D(III)循环水多用真空泵；RE52CS-2型旋转蒸发仪；纯净水，杭州娃哈哈集团有限公司；分析纯乙醇、石油醚、正丁醇，天津福晨化学试剂厂；分析纯丙酮、乙酸乙酯，上海邦成化工有限公司；200～300目柱层析色谱硅胶，奥普斯仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 老瓜头提取物的制备 每次取老瓜头样品1 000 g，分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、纯净水，在超声波清洗仪中浸提3次，每次30 min，合并浸提液，利用旋转蒸发仪旋蒸浸提液，至浸提液成为膏状后，回收溶剂；得到老瓜头不同溶剂的提取物。装入试剂瓶中，置于4℃冰箱内保存备用。

1.2.2 老瓜头杀虫活性 研究所用的实验的提取物浓度均为400 mg/mL，打孔器直径d=0.80 cm，养虫瓶高度h=10 cm，直径d=8 cm。采用小叶碟法[22]测定不同提取物对粘虫和小地老虎3龄幼虫以及枣飞象成虫的胃毒活性。具体方法：将新鲜的玉米叶片用圆形打孔器打成叶碟，置于配制好的400 mg/mL药液中浸渍3～5 s，自然晾干后，放入养虫瓶中，再接入饥饿4 h的粘虫和小地老虎；将新鲜的枣树叶片用圆形打孔器打成叶碟，置于配制好的药液中浸渍3～5 s，自然晾干后，接入饥饿4 h的枣飞象成虫。

采用微量点滴法[23]测定试材对粘虫、枣飞象和小地老虎的触杀作用，以微量点滴仪点滴药液至粘虫和小地老虎3龄幼虫前胸背板及枣飞象成虫腹面，以点滴等量丙酮为对照。采用玻片浸渍法[23]测定试材对山楂叶螨的触杀作用。以吐温-80水溶液稀释老瓜头不同提取物至供试质量浓度，将粘好的山楂叶螨玻片在药液中浸渍3～5 s取出，用吸水纸吸去多余药液，以吐温-80水溶液作为空白对照。

上述杀虫活性反应中，各处理均重复3次，其中粘虫、枣飞象和小地老虎每重复30头试虫，山楂叶螨每重复50头试虫。处理后，均放置于养虫室，温度26±1℃，相对湿度为65±15%，光和暗周期为12 h∶12 h饲养，分别于处理后24 h和48 h进行统计，计算校正死亡率。

分别对石油醚、乙酸乙酯、正丁醇和水提取物进行同等剂量下的杀虫活性比较，确定正丁醇提取物的杀虫活性最高，对其进一步进行柱层析分离，以100头粘虫3龄幼虫为供试昆虫进行活性追踪试验。具体步骤：取25 g正丁醇提取物，用少量正丁醇溶解后吸附在一定硅胶上进行硅胶柱层析，用正丁醇/乙酸乙酯(体积比100∶1、50∶1、30∶1、20∶1、10∶1、5∶1、3∶1、1∶1)、乙酸乙酯、丙酮和甲醇依次洗脱。测定各洗脱组分的杀虫活性，每种昆虫的供试数量为80头，进一步选取高活性组分段进行二次硅胶柱层析，依次使用用正丁醇/丙酮(体积比同上)、丙酮和甲醇洗脱。

1.3 数据分析

采用SPSS 2.0进行数据统计分析，应用Duncan氏新复极差法进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 老瓜头不同溶剂提取物对枣飞象成虫杀虫活性

溶剂提取物对枣飞象成虫杀虫活性测定结果见(表1)，不难看出400 mg/mL水、石油醚、乙酸乙酯和正丁醇提取物中，正丁醇提取物对粘虫的杀虫活性最高，显著高于其它3种溶剂提取物(P<0.05)。正丁醇提取物胃毒处理枣飞象24 h和48 h后，校正死亡率分别为68.4%和73.4%，触杀处理24 h和48 h，枣飞象校正死亡率分别为55.2%和64.8%，正丁醇提取物对枣飞象的胃毒活性优于触杀活性。水提取物对枣飞象的杀虫活性最差。枣飞象胃毒处理24 h和48 h，校正死亡率分别为8.3%和12.6%；触杀处理24 h和48 h，校正死亡率分别为14.3%和15.1%。老瓜头石油醚提取物与乙酸乙酯提取物对枣飞象的胃毒和触杀效果较差，胃毒校正死亡率为30%～45%，触杀校正死亡率为25%～40%，石油醚和乙酸乙酯提取物对枣飞象杀虫活性无显著差异。

2.2 老瓜头不同溶剂提取物对粘虫幼虫杀虫活性

由表2可知，老瓜头水、石油醚、乙酸乙酯和正丁醇提取物浓度为400 mg/mL时，正丁醇提取物处理粘虫24 h和48 h，触杀校正死亡率分别为58.7%和63.9%，而胃毒校正死亡率分别为68.7%和72.3%。正丁醇提取物对粘虫的杀虫活性最好，显著高于其它3种溶剂提取物(P<0.05)，且正丁醇提取物对粘虫的胃毒效果优于触杀效果。水提物处理粘虫24 h和48 h，触杀校正死亡率分别为13.1%和15.8%，而胃毒校正死亡率分别为25.1%和32.2%。老瓜头水提取物对粘虫的触杀和胃毒效果最差。老瓜头石油醚提取物与乙酸乙酯提取物对粘虫的胃毒和触杀效果较差，触杀校正死亡率为22%～32%，胃毒校正死亡率为34%～48%，石油醚和乙酸乙酯提取物对粘虫杀虫活性无显著差异。

表1 老瓜头不同极性提取物对枣飞象成虫的杀虫活性

表2 老瓜头不同溶剂提取物对粘虫3龄幼虫的毒杀活性

2.3 老瓜头不同溶剂提取物对小地老虎杀虫活性

老瓜头不同溶剂提取物对小地老虎幼虫杀虫活性测定结果见(表3)，由表可知400 mg/mL水、石油醚、乙酸乙酯和正丁醇提取物中，正丁醇提取物正丁醇的杀虫活性最好，显著高于其它3种溶剂提取物(P<0.05)。正丁醇提取物对小地老虎的胃毒活性显著优于触杀活性。胃毒处理24 h和48 h，小地老虎的校正死亡率为64.1%和68.2%，而触杀处理24 h和48 h，小地老虎的校正死亡率为37.9%和42.4%。其次为老瓜头石油醚提取物处理24 h和48 h，对小地老虎的触杀效果分别为24.2%和29.4%，而胃毒校正死亡率分别为48.7%和55.6%；老瓜头水提取物与乙酸乙酯提取物对小地老虎的胃毒和触杀效果最差，48 h触杀校正死亡率为13%～19%，48 h胃毒校正死亡率为26%～39%，水和乙酸乙酯提取物对小地老虎杀虫活性无显著差异。

表3 老瓜头不同溶剂提取物对小地老虎3龄幼虫的毒杀活性

2.4 老瓜头不同溶剂提取物对山楂叶螨杀虫活性

老瓜头不同溶剂提取物对山楂叶螨触杀活性测定结果见(表4)，由表可知400 mg/mL老瓜头水、石油醚、乙酸乙酯和正丁醇提取物中，乙酸乙酯和正丁醇的触杀活性较好，乙酸乙酯处理24 h和48 h，校正死亡率分别为53.4%和58.2%，正丁醇处理24 h和48 h，校正死亡率分别为55.7%和60.7%，即老瓜头乙酸乙酯和正丁醇提取物对山楂叶螨触杀活性无显著差异。老瓜头水提取物对山楂叶螨的触杀活性最差，处理24 h和48 h，校正死亡率分别为26.3%和31.1%；而老瓜头石油醚提取物处理24 h和48 h，校正死亡率分别为44.2%和50.5%。

表4 老瓜头不同溶剂提取物对山楂叶螨的触杀活性

2.5 老瓜头正丁醇提取物柱层析不同组分对粘虫的杀虫活性测定

经薄层层析分离老瓜头正丁醇提取物，得到11个组分，按照洗脱顺序分别标记为X1～X11。对这11个组分进行生测，测定其对粘虫3龄幼虫的杀虫活性，结果如表5，表明正丁醇提取物的活性成分主要集中在X4中。测定X4组分对枣飞象、粘虫、小地老虎和山楂叶螨的杀虫活性，由表6可知，老瓜头正丁醇段提取物X4组分对枣飞象、粘虫、小地老虎和山楂叶螨的24 h和48 h的触杀校正死亡率为70%～80%，而对枣飞象、粘虫和小地老虎24 h和48 h的胃毒校正死亡率为大于90%。研究结果表明X4组分对枣飞象、粘虫和小地老虎的胃毒效果优于触杀效果。因此，今后以老瓜头正丁醇提取物X4组分为先导化合物，进行其类似化合物的合成，为研发植物源杀虫剂奠定基础。

表5 老瓜头正丁醇提取物薄层层析不同组分对粘虫3龄幼虫的杀虫活性

表6 老瓜头正丁醇段提取物X4组分的杀虫活性

3 讨论与结论

老瓜头是一种广泛的分布于陕北地区的一种毒草资源。研究将的老瓜头通过不同溶剂萃取获得不同溶剂提取物，并测定其对枣飞象、粘虫、小地老虎和山楂叶螨的杀虫活性。老瓜头正丁醇提取物对枣飞象、粘虫和小地老虎的杀虫活性最好，且其胃毒效果优于触杀效果。这和张维库[15]对粘虫的研究结果并不一致。主要原因为笔者研究的提取物含有的物质可能不是生物碱。老瓜头水提取物的杀虫活性最差，胃毒和触杀处理48 h，供试昆虫的校正死亡率小于35%。这和美国白蛾[18]等的研究结果不一致，主要原因为水为极性溶剂，提取出的老瓜头活性物质和其它三种溶剂并不相同，也可能是不同处理方法造成的。

通过对山楂叶螨杀虫活性测定发现，老瓜头正丁醇和乙酸乙酯提取物对山楂叶螨的触杀活性最好，触杀处理48 h，校正死亡率分别为60.7%和58.2%，石油醚提取物次之，校正死亡率为50.5%，老瓜头水相提取物最差，校正死亡率为31.1%。研究结果表明，老瓜头水相的杀虫活性最差，这于刘晨[17]等对地红蝽的研究结果一致，主要原因为老瓜头内吸性溶剂存在于正丁醇和乙酸乙酯中。

笔者研究对老瓜头正丁醇提取物进行柱层析分离，获得11个不同组分，对粘虫3龄幼虫进行杀虫活性测定发现，X4组分的杀虫活性最好，即老瓜头杀虫活性物质主要集中在X4组分中，且X4组分的胃毒效果优于触杀效果。剡根姣等[19]研究发现，老瓜头乙醇提取物对小菜蛾具有较好的拒食作用，观察发现老瓜头乙醇提取物对小菜蛾的口器感受器具有破坏性，杨曼[18]研究发现，老瓜头水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯和丙酮5种溶剂粗提物中甲醇提取物和乙醇提取物对美国白蛾的胃毒活性强烈，笔者研究结果与之一致，可能是由于老瓜头生物碱中的杀虫活性物质溶于醇类有机溶剂。

老瓜头作为植物药用资源有很大的研发空间与价值，开发和利用沙区有毒植物老瓜头作为植物源农药，可以解决该植物的资源合理利用问题。研究初步明确了老瓜头正丁醇提取物的杀虫活性较好，对鳞翅目和鞘翅目的胃毒和触杀效果均较好，且对山楂叶螨的触杀效果也较好，即老瓜头是一种潜在的与可开发的资源。研究为植物源杀虫剂的研发奠定了一定的理论基础。